دانلود مقاله مواد و روش ها و انتخاب دام

مواد و روشها و انتخاب دام 1) آماده سازی تعداد 2000 اسلاید جهت تهیه گسترش خون از رگهای جداری و رگهای عمقی و بررسی ریزبینی 2) آماده سازی سوزنهای پونکسیون جهت تهیه بیوپسی از غدد لنفی سطحی ( بخصوص پیش کتفی) تهیه گسترش بمنظور بررسی ریزبینی 3) تهیه لوله های ونوجکت(Veno ject ) حدود 2000 عدد جهت گرفتن خون و تهیه سرم و نگهداری آنها در منهای بیست در جه تا موقع انجام تست های سرمی( تست الیزا) 4) تهیه آنتی ژن لیوفیلیزه وآنتی ژن سونیکه 1-4 روش تهیه آنتی ژن بیوفیلیزه جهت انجام تست تیلرین سلولهای میلوئید آلوده به شیتروین تیلریااتولاتا (Schzour Infected mylord alls) رااز پاساز های پائین سویه های جداشده تهیه نموده و سپس سلولهای تهیه شده را در دور rpm 1600با محلول PBS دوبار شستشو داده سپس برمبنای کنسانتره سلولی را تهیه نموده و در شیشه های مخصوص لیوفیلیزه 4 میلی لیتری و 8 میلی لیتری هر کدام یک میلی لینر تقسیم و سپس با دستگاه لیوفیلیزه آنها را لیوفیلیزه نموده و تا موقع مصرف در نگهداری می گردند در موقع مصرف به هر شیشه یک میلی لتر آب دوبار تقطیر شده استریل اضافه نموده و پس از تکان دان بعنوان آنتی ژن از آن استفاده می شود لازم به یادآوری است که میزان سلول در کنسانتره باید باندازه ای باشد که غلظت پروتئین مورد لزوم برای تزریق بر مبنای در نظر گرفته می شود.

2-4 روش تهیه آنتی ژن سونیکاسیون جهت انجام تست تیلرین کنسانتره سلولهای میلوئید آلوده به شیتروین تیلریااتولاتا همانند روش لیوفیلیزه تهیه نموده و تعداد سلول را در هر میلی لیتر به میرسانیم و پس از دو بار شستشو با PBS در دور 1600 در دقیقه با دستاه سونیکاتور به برای مدت 5 دقیقه سونیکه نموده و در g 1000 به مدت ده دقیقه سانتریفوژ شده و به مدت سه بار با PBS شستشو داده می شود.

انتخاب دام جهت بررسی های آزمایشگاهی در طی سالهای 84-83 جمعاً چهار رأس گوساله هلندی بین 5-4 ماه از دامداریهایی که تیلریوز در سال گذشته نداشته انتخاب شدند و در اصطبل فاقد کنه(Tick free stall ) نگهداری شدند.

گوساله ها مدت یک ما ه مورد بررسی های ضروری قرار گرفتند از عدم آلودگی آنها اطمینان حاصل شد و سپس جهت بررسی طرح تداوم ایمنیی مورد استفاده قرار گرفتند.

و مایع روئی به عنوان آنتی ژن درنظر گرفته می شود سپس توتال پروتئین آنتی ژن تهیه شده بر مبنای بدست آورده و آن را تا موقع مصرف در چهار درج سانتی گراد نگهداری مینمائیم.

روش تهیه آنتی ژن تیلر یا آنوکات به روش هموژنیزه با دستگاه (Homogenizer) 1) پاساژ سلول های میلوئید شیتروین تیلریااتولاتا در 10 ساعت به حجم تقریبی هر کدام 150ml (Rachani1992 ) 2) جمع آوری سلولها در شروع مرحله ایستا(Statcnary ) 3) سانتریفوژ نمودن و حذف محیط کشت با سه بار شستشو در محیط PBS 4) ذوب و منجمدنمودن سلولها در و برای دوبار 5) هموژنیزه کردن سلولها د رسه سیکل 10 دقیقه در دور( 260prm ) 6) دوبار ذوب و انجماد نمودن مجدد 7) سانتریفوژ در دو نوبت در دور 2000g به مدت 30 دقیقه 8) استفاده از مایع روئی بعنوان آنتی ژن 9) پروتئین سنجی اندازه گیری پروتئین تنظیم آنتی ژن بر مبنای غلظت توتال پروتئین انتخاب دام جهت بررسی های صحرائی د رتاریخ 31/6/83 و 7/7/83 طبق ضوابط ذیل جمعاض 92 رأس زا هفت گاوداری با نظر متخصص اپیدمیولوژیک انتخاب گردید ضوابط ددر نظر گرفته جهت انتخاب دامهای تحت بررسی عبارت بودند از: 1) عاری بودن دامها از الودگی های تک یاخته ای 2) مناسب بودن وضع عمومی دامها با اشتهای خوب و علائم لاغری 3) عدم آلودگی به بیماری های باکتریائی ، ویروسی و قارچی 4) عدم آلودگی به انگل های درونی 5) مایه کوبی مرتب بر علیه بیماریهای باکتریایی و ویروسی( شاربن، پاستروازر، طاعون، تب فرچکی و شاربن غلاتتی در اسنفد ماه 1384 کلیه دامهای گروه اول واکسینه شده گروههای دوم و سوم واکسینه نشده اند.

در تاریخ 31/2/84 از کلیه دامهای گاوداری اصغر خراشانی که قبلاً مایه کوبی بر ضد تیلریوز شده تست لوزبر تست تیلرین با آنتی ژن لیوفیلیزه و آنتی ژن سونیک تیلر یا آنکوتا اتنجام گردید به منظور انجام تست الیزا خون گیری انجام و گسترش خونی نیتر از کلیه دامها تهیه گردید.( تعداد داام تست بررسی در این گاوداری برای 8 رأس می باشد) در تاریخ 31/2/84 ازکلیه دامهای گاوداری، رسول خراسانی که قبلاً مایه کوبی بر ضد تیلریور شده بودند تست تیلیرین بااستفاده از آنتی ژن لیونیلیزه و آنتی ژن سونیکه تیلر یا آنرکلاتا انجام گردی بمنظور انجام تست FLISH خون گیری انجام شد و گسترش خون نیز تهیه گردید.( تعداد دادم تحت بررسی در این گاوداری برابر 24 رأس می باشد) در تاریخ 1/3/84 از کلیه دامهای گاوداری اباصط رضائی که قبلاً برضد تیلرلوز مایه کوبی شده بودند تست تیلرین با استفاده از آنتی ژن لیونیلیزه و آنتی ژن سونیکه تیلر یا آنوکاتا انجام گردید و بمنظور انجام تست الیزا(ELISA ) خون گیری انجم شده و گسترش خون نیز تهیه گردید( تعداد دام تحت بررسی در این گاوداری برابر 2 رأس می باشد.

در تاریخ 1/3/84 از کلیه دامهای گاوداری موسی رضائی که قبلاً بر ضد تیلرلوز مایه کوبی شده بودند تست تیلرین با استفاده از آنتی ژن بیونیلیزه و آنتی ژن سونیکه تیلر یا آنولاتا انجام گردید و بمنظور انجام تست الیزا(ELISA ) خون گیری انجام شد و گسترش خون نیز تهیه گردید( تعداد دام تحت بررسی در این گاوداری برابر 2 رأس می باشد) در تاریخ 4/4/84 از کلیه دامهای گاوداری حاج رضا زندی تست تیلرین با استفاده از آنتی ژن بیونیلیزه و آنتی ژن سونیکه تیلر یا آنولاتا انجام شد و خون گیری جهت انجام تست الیزا انجام و گسترش خون نیز تهیه گردید.

( تعداد دام تحت بررسی در این گاوداری برابر 9/1 رأس می باشد) در تاریخ 4/4/84 از کلیه دامهای گاوداری ناصر جباری که قبلاً بر ضد تیلریوز مایه کوبی شده بودند تست تیلرین با استفاده از آنتی ژن بیونیلیزه تیلر یا آنوکاتا انجام شد و جهت تست الیزا خون گیری انجام گردید و ضمناً گسترش خون نیز تهیه گردید( تعداد دام تحت بررسی در این گاوداری برابر 5 رأس می باشد) در تاریخ 4/484 از کلیه دامهای گاوداری حاج اکبر زندی که قبلا ً بر ضد تیلریوز مایه کوبی شده بودند تست تیلرین با استفاده از آنتی ژن بیونیلیزه تیلر یا آنولاتا انجام شده و جهت تست الیز خون گیری انجام گردید و ضمناً گسترش خون نیز تهیه گردید( تعداد دام تحت بررسی در این گاوداری برابر 8 رأس بوده است) در تاریخ 31/2/84 از کلیه دامهای گاوداری اصغر خراشانی که قبلاً مایه کوبی بر ضد تیلریوز شده تست لوزبر تست تیلرین با آنتی ژن لیوفیلیزه و آنتی ژن سونیک تیلر یا آنکوتا اتنجام گردید به منظور انجام تست الیزا خون گیری انجام و گسترش خونی نیتر از کلیه دامها تهیه گردید.( تعداد داام تست بررسی در این گاوداری برای 8 رأس می باشد) در تاریخ 31/2/84 ازکلیه دامهای گاوداری، رسول خراسانی که قبلاً مایه کوبی بر ضد تیلریور شده بودند تست تیلیرین بااستفاده از آنتی ژن لیونیلیزه و آنتی ژن سونیکه تیلر یا آنرکلاتا انجام گردی بمنظور انجام تست FLISH خون گیری انجام شد و گسترش خون نیز تهیه گردید.( تعداد دادم تحت بررسی در این گاوداری برابر 24 رأس می باشد) در تاریخ 1/3/84 از کلیه دامهای گاوداری اباصط رضائی که قبلاً برضد تیلرلوز مایه کوبی شده بودند تست تیلرین با استفاده از آنتی ژن لیونیلیزه و آنتی ژن سونیکه تیلر یا آنوکاتا انجام گردید و بمنظور انجام تست الیزا(ELISA ) خون گیری انجم شده و گسترش خون نیز تهیه گردید( تعداد دام تحت بررسی در این گاوداری برابر 2 رأس می باشد.

( تعداد دام تحت بررسی در این گاوداری برابر 9/1 رأس می باشد) در تاریخ 4/4/84 از کلیه دامهای گاوداری ناصر جباری که قبلاً بر ضد تیلریوز مایه کوبی شده بودند تست تیلرین با استفاده از آنتی ژن بیونیلیزه تیلر یا آنوکاتا انجام شد و جهت تست الیزا خون گیری انجام گردید و ضمناً گسترش خون نیز تهیه گردید( تعداد دام تحت بررسی در این گاوداری برابر 5 رأس می باشد) در تاریخ 4/484 از کلیه دامهای گاوداری حاج اکبر زندی که قبلا ً بر ضد تیلریوز مایه کوبی شده بودند تست تیلرین با استفاده از آنتی ژن بیونیلیزه تیلر یا آنولاتا انجام شده و جهت تست الیز خون گیری انجام گردید و ضمناً گسترش خون نیز تهیه گردید( تعداد دام تحت بررسی در این گاوداری برابر 8 رأس بوده است) بررسی های انجام شده در 9 جدول ( جداول 9-2) در صفحات ارائه شده است.

جدول شماره 22 3/7/84 گاوداری اباصط رضایی بازدید کنترل دامهای تحت بررسی جدول شماره 12 تاریخ 3/7/84 بازدید و کنترل دامهای تحت بررسی گاوداری موسی رضائی سرویس حذف شده یک رأس مرده است.

جدول شماره 13 گاوداری رضا زندی تاریخ بازدید 10/7/84 دو رأس شماره ندارند خون گیری انجام نشد.

سایر فعالیت های انجام شده الف- جداسازی نمونه های آلوده به تیلریا آنولاتا تهیه سویه های جدید حاد و فوق حاد جهت تداوم سیرویاهی مربوط به تیلریوز در تاریخ 15/2/84 گوساله هلندی ی اصیل بشماره 2/450 تحت عمل جراحی قرار گرفت و طحال آن برداشته شد(Splenictency )، گوساله مزبور مدت یماه تحت کنترل قرار داده شد و در طی این مدت هفته ای سه بار از رگهای سطحی و عمیق و غده پیش کتفی دام مزبور نمونه خون، نمونه غده، برداشت پس از تهیه گسترش بررسی ریزبینی انجام گردید ضمناً از طحال برداشته شده نیز گسترش لازم تهیه گردید و بررسی های انجام شده نشان دادند که گوساهبه انتخاب شده به تیلریوز و سایر تک ها ی خونی آلوده نبوده است سپس واکسنهای لازم به دام مزبور تزریق شد و برای بررسی های بعدی آماده گردید.

در تاریخ 15/3/84 ، 40 میلی لیتر خون آلوده به تیلریور دادخل رگی به گوساله شماره 1450 و تزریق گردید.( لازم به یادآوری است که خون آلوده توسط دکتر بهمن جاوید لامعی از منطقه بوئین زهرا ارسال شده بود.) گوساله شماره 1450وپس از تزریق خون آلوده تحت بررسی قرار گرفت و واکسنهای حرارتی دام در کمون و در مرحله بحران به شرح زیر می باشد.

در تاریخ 16/3/84 درجه حرارت بدن دام به رسید و مدت دو روز تب ادامه یافت.

« معمولاً درصد نمونه های جداشده از دامهائی که به تیلریوز حخاد مبتلا هستند در کمون بیماری به مدت 2 الی سه روز تب زودگذر ظهور یافته و پس از آن تا ظهور بحران واکنش های حرارتی و انگلی دام تزریق شده مشاهده نمی شود.

مغذلک مکانیسم واقعی آن مشخص نیست احتمالاً تهییج اولیه سیستم دفاعی نقش موثری در هظو این پدیده داشته باشد».

در تاریخ 28/3/84 علائم درمانگاهی تیلریوز حاد و تب بالا وجود تک یاخته در خون مشاهده شد و میزان پارازی تیما(Parasi taema ) به 8% رسید.

درتاریخ 29/3/84 در گسترش های تهیه شده از غده لنفی پیش کتفیگوساله سلولهای آلوده به شیزونت به میزان CB++ و وجود تک یاخته در خون به میزان 25% مشاهده گردیدو در تاریخ 3/3/84 گوساله تحت بررسی از تیلریوز حاد تلف گردید.

در کالبدگشائی و مشاهده اندامهای درونی و بررسی های ریزبینی علائم مشخصه تیلریوز حاد نشان داده شد.

از غدد لنفاوی و پیش کتفی نمونه برداری انجام و در محیط استوکر واجد 10% سرم کشت داده شد ضمناً در تاریخ 29/3/84 از دام آلوده خون گیری انجام و به گوساله شماره 3/449 حدود 40 میلی لیتر خون زیرجلدی تزریق گردید.

در تاریخ 15/4/84 پس از گذراندن کمون، واکنش های حرارتی و انگلی در گوسابه شماره 3/449 مشاهده گردید و میزان آلودگی گلبولهای قرمز به 10% رسید و در گسترش های ناشی از غدد لنفاوی نیز شیزونت تیلر یا آنولاتا به میزان CB+++ مشاهده گردید بمنظور بررسی واکنش های حرارتی و انگلی سویه جداشده و داستن واکنش های یکنواخت و ارزیابی سویه مزبور خون گوساله شماره 3/449 به گوساله شماره 4/452 زیر جلد تزریق گردید.

در تاریخ 17/4/84 پارازی تمپا درگوساله شماره 3/449 به 40% رسید و گوساله مزبور در تاریخ 20/4/84 از تیلریوز تلف گردید.

ا زکبد،غدد لنفاوی مزاتر و غدد پیش کتفی گوساله 4/449 نمونه های لازم تهیه و پس از هموژنیزه کردن دو محیط استوکر همراه با 10%سرم کشت داده شده نمونه کشت داده شده در پاساژپنجم با استفاده از گلیرین در شرایط انجماد نگهداری شده.

بعنوان نمونه جداشده بوئین زهرا نامگذاری گردید(Bounzahra Islato).

سرنوشت گوساله 6/652 در بررسی های دیگری که بمنظور جداسازی نمونه های آلوده به تیلر یا انوکتار انجام شده د ر نمونه دیگری نیز از گوساله های تزریق شده در آزمایشگاه تهیه و در محیط استوکر کشت داده شد.

و نمونه های کشت داده شده بنام C2,C1 نامگذاری گردید کشت شماره C1 تا پاساژ 25 و کشت شماره C2 تا پاساژ 34 در محیط کشت پاساژ داده شد و در پاساژ های پنجم و پانزدهم و بیست و پنجم نمونه های کشت پس از اضافه کردن گلیسری در ازت مایع بصور منجمد نگهداری شد.

ضمناً لیزات سلولی بمنظور تخلیص Total RAN و بررسی بیان ژن MMP تهیه گردید وضعیت تیلریوز در منطقه بوئین زهرا در طی شش ماهه اول سال 1384 بخصوص در ماههای بحرانی تیلریور گاوی ماههای خرداد، تیر ماه و مردادمان و شهریور ماه به دو درمانگاه در بوئین زهرا جهت بررسی وضع تیلریوز مراجعه نمودیم.

همانطور که در گزارش قبلی نیز اطلاع داده شد بمنظور صرفه جوییی در هزینه های مربوط به طرح طبق نظر اپیدمیولوژیست با توجه به آلودگی منطقه به تیلریوز گروه چهارم از دامهای گاوداریهاییکه واکسن نخورده بودند انتخاب شدند وبه همین منظور گزارش نویسی دو درمانگاه از نقطه نظر آلودگی به تیلریوز، درمان دامهای آلوده و تلفات حاصله از تیلریوز دریافت گردیده که درقسمت نتایج بحث می گردد.

نتایج و بحث کلیه دامهای سه گروه اول و دوم و سوم که در اسفندماه 1383 بر ضد تیلریوز گاوی مایه کوبی شده بودند در ماههی بحرانی وجود تیلریوز گاوی( اواسط اردیبهشت لغایت پایان شهریور ماه 1384) هیچگونه علائم که حاکی از وجود تیلریوز گاوی باشد نداشته اند معذلک یادآورمی شود که گروه چهرام که درطی دوره پنج سال نباید واکسینه شوند بعنوان شاهد درنظر گرفته شده بودند آلودگی به تیلریوز و تلفات ناشی از تیلریوز گاوی مشاهده گردید.

و خلاصه نتایج بررسی گروه چهارم با مراجعه به دو درمانگاه بخش خصوصی در بوئین زهرا به شرح زیر می باشد.

در دامهائی که واکسینه شده بودند تیلریوز گاوی گسترش داشته و جدول زیر معرف مراجعه دامهای مبتلا به تیلریوز به درمانگاه می باشد.

جدول شماره 14 معرف دامهای مبتلا به تیلریوز که در درمانگاه آورده شده بودند می باشد.

بنابراین تعداد 1011 رأس مشکوک یا آلوده به تیلریوز به درمانگاه آورده شده بودند که 3% از آنها از تیلریوز تلف شده و بقیه با استفاده از دارو درمان شده بودند.

کلیه دامهای تحت بررسی( جداول شماره(12-2) در بازدیدهای تکفرد انجام شده در طی شش ماه اول سال( جمعاً 6 ) مشکل خارجی که قابل ملاحظه باشد نداشته اند.

در گسترش های تهیه شده از دامهای تحت بررسی( جداول شماره 12-2) آلودگی به تک یاخته های خونی بخصوص تیلر یا آنوکاتا مشاهده نگردید.

نتایج حاصلیه از تست تیلریی به شرح زیر می باشد: الف: از 88 رأس دام شش گاو داری که در تاریخ ........

مایه کوبی تیلریوز شده در بر ضد تیلریوز شده و در ادامه تست تیلرین با استفاد از آنتی ژن یا آنول انجام شده و در 52/27% دامها تست تیلرین نسبت و در 47/72% دامها تست تیلرین منفی بود ه است.

ب: از 73 رأس دام شش گاوداری در بوئین زهرا که در تاریخ.........

مایه کوبی برضد تیلریوز شدند 2ماه تست تیلری با استفاده از آنتی ژن سونیکو تیلر یا آنولاتا انجام شده و 54-79% تست تیلریا مثبت بوده و در 45/20 از دامها تست تیلری منفی بوده است.

افزایش سهم- تست الیزا جهت بررسی برقرار شده(set up ) و بررسی های مربوطه در گزارش بعدی ارائه می گردد بطورکلی منابع فعالیت های انجام شده تاکنون مثبت بوده است و ضرورت دارد ادامه یابد.

ردیفتاریخ مراجعهانتخاب دام و شماره زنیمایه کوبیتهیه گسترش خونتهیه سرمتست تیلرینوضعیت عمومی دام131/6/83+----مطلوب +27/7/83 7/9/83 7/11/83+----مطلوب +311/12/83-+++-مطلوب +417/12/83-+++-مطلوب +531/2/84--+++مطلوب +61/3/84--+++مطلوب +73/3/84--+-+مطلوب +84/3/84 4/4/84 7/4/84--+++مطلوب +93/7/84-++مطلوب +1010/7/84-++مطلوب +1124/7/84 11/1084 16/11/84صرفاً بحث با مسئولین شبکه دامپزشکی بوئین زهرا، مسئولین درمانگاههای فصلی اداره کل دامپزشکی جهت اجرا طرح تداوم ایلی تیلریوز گاویصرفاً بحث با مسئولین شبکه دامپزشکی بوئین زهرا، مسئولین درمانگاههای فصلی اداره کل دامپزشکی جهت اجرا طرح تداوم ایلی تیلریوز گاویصرفاً بحث با مسئولین شبکه دامپزشکی بوئین زهرا، مسئولین درمانگاههای فصلی اداره کل دامپزشکی جهت اجرا طرح تداوم ایلی تیلریوز گاویصرفاً بحث با مسئولین شبکه دامپزشکی بوئین زهرا، مسئولین درمانگاههای فصلی اداره کل دامپزشکی جهت اجرا طرح تداوم ایلی تیلریوز گاویصرفاً بحث با مسئولین شبکه دامپزشکی بوئین زهرا، مسئولین درمانگاههای فصلی اداره کل دامپزشکی جهت اجرا طرح تداوم ایلی تیلریوز گاویصرفاً بحث با مسئولین شبکه دامپزشکی بوئین زهرا، مسئولین درمانگاههای فصلی اداره کل دامپزشکی جهت اجرا طرح تداوم ایلی تیلریوز گاوی ردیفشماره داموضعیت دامخون گیری برای تهیه سرمگسترش خون1324مطلوب آبستنی 8 ماهه++2326مطلوب++3327مطلوب++4328مطلوب آبستنی چهار ماهه++5329مطلوب++6330مطلوب++7333مطلوب++8334مطلوب آبستنی 8 ماهه++9335مطلوب++10337مطلوب++11338مطلوب++12342مطلوب+13343مطلوب++14344مطلوب++15345مطلوب++16346مطلوب++17347مطلوب++18348مطلوب++19349مطلوب++20351مطلوب++21352مطلوب++22353مطلوب++23354مطلوب++24356مطلوب++25357مطلوب++ ردیفشماره داموضعیت عمومیخون گیریگسترش1301مطلوب++2302مطلوب++3303مطلوب++4305مطلوب++5306مطلوب++7308مطلوب++8309مطلوب++9310مطلوب++10311مطلوب++11312مطلوب++12313مطلوب++13314مطلوب++14315مطلوب++15316مطلوب++16318مطلوب++17319مطلوب++18320مطلوب++19323مطلوب++ ردیفشماره داموضعیت عمومی دامتهیه سرمگسترش خون173مطلوب++274مطلوب++376مطلوب++478مطلوب++579مطلوب++680مطلوب++783مطلوب++ تاریخ مراجعه دامدارتعداد دام آورده شده به درمانگاه شماره یکتعداد دامهای آورده شده به درمانگاه شماره 2اردیبهشت ماه 8456 رأس250 رأسخرداد ماه 8460 رأس370رأستیر ماه 8441 رأس140 رأسمرداد ماه 8410 رأس79 رأسشهریور5 رأس-جمع172 رأس839