موضوع : پروتئین ، CDNA و شناسایی گرن تظاهر ژن عبارتست از طی مراحلی که منجر به ایجاد فراورده ژن می گردد .
برای اینکه ژن فراورده خود را تولید کند ، باید دو مرحله اساسی انجام شود : نسخه برداری Transcription ترجمه transtation نسخه برداری: اولین مرحله از تظاهر ژن است ، یوکاریوتها شامل قارچها ، گیاهان ، حیوانات، انسان و بعضی موجودات تک سلولی و پروکاریوتها عبارت از موجودات تک سلولی و مهمترین انها باکتریها هستند .
تظاهر ژن در این دو دسته شباهتهای زیادی دارند و تفاوتهایی نیز در انها وجود دارد .
بعنوان مثال در یوکاریوتها : انزیم مهمی که در نسخه برداری ژن دخالت وسیع دارد بنام RNA Palymerase نامیده می شود .
و در انسان سه نوع از این انزیم بنامهای RNA Pely merase I , II , III شناخته شده است .
و هر کدام در دسته بخصوصی از ژنها عمل می کنند .
مثلا پلی مراز III در نسخه برداری ژنهای TRNA و پلی مراز II در نسخه برداری ژنهای rRNA دخالت دارند .
نسخه برداری در ژن از یک حمل خاصی شروع و در یک محل دیگری از ژن پایان می یابد یعنی در یک خط راهنما و یکطرف انجام می شود و در روی Template DNA بصورت 3/ à 5/ است ولی در روی RNA بر عکس و 5/ à3/ است .
DNA Template رشته ای از DNA است که ژن مربوطه که نسخه برداری آن انجام می شود در آن قرار دارد .
شکل شروع نسخه برداری یعنی ایجاد RNA از روی DNA می باشد ، با این تفاوت که بجای باز تعیین T با اوراسیل U در RNA قرار می گیرد .
چون RNA بصورت معکوس با DNA قرار دارد و خط راهنمای DNA بصورت 3/ à 5/ است بنابراین RNA از 5/ شروع و به 3/ ختم می شود .
در شروع نسخه برداری پلی مراز II محلی را در ابتدای ژن انتخاب می کند که در منطقه Upstream ژن قرار دارد و پلی مرازII در محلی در خارج از نقطه شروع نسخه برداری به DNA می چسبد و بصورت یک مجموعه Complen در می اید و محل چسبیدن رشته DNA در ژن مربوطه بصورت 5/ TATAAT- 3/ که بطور خلاصه TATA نشان داده می شود که تا محل شروع نسخه برداری 25 نوکلئوتید فاصله دارد و بهمین جهت -25 Bon نوشته می شود .
منطقه انتقال انزیم پلیمراز RNA به DNA بنام پروموتر است .
و بوسیله انزیم فوق شناسایی می شود .
و به کمک فاکتورهایی بنام T.F انجام می گیرد .
مرحله پایان نسخه برداری نسخه برداری زمانی تمام می شود که یک رشته دنباله ای مرکب از نوکلئوتیدهای ادنوزین یا PolyA به R.N.A اضافه شده است .
در بعضی از ژنها این دنباله تا Zpppbp در ناحیه Down Stream ژن ادامه می یابد .
شکل قبل از بحث ترجمه بطور مختصر انواع RNA را مورد بررسی قرار می دهیم : 1- RNA ریبوزومی : که بصورت rRNA نوشته می وشد و جزیی از ساختمان ریبوزوم می باشد و نقش بسیار مهمی در ترجمه ژن بعهده دارند .
2- RNA ناقل یا tRNA : یکنوع RNA ناقل است و نقش اساسی ان در ترجمه ژن می باشد .
این نوع RNA که نقش جابجایی اسیدهای امینه در سیتوپلاسم سلول را بعهده دارد اولین بار توسط دانشمندی بنام رابرت هولی در سال 1959 از سلول جدا گردید و در مدت 6 سال زنجیره کامل انرا شناسایی کرد .
tRNA دارای 74-94 نوکلئوتید است و نسبتا RNA کوچک به حساب می اید .
ساختمان کلی tRNA که بصورت برگ شبدر است بخشهای زیر را دارا است : بازوی دریافت کننده The acceptor arm بازوی انتی کرون The anti conton arm بازوی D.H.U حلقه اضافی Optional arm حلقه Tucarm بطور خلاصه یک مولکول tRNA شامل سه حلقه و یک بازوی انتهایی که حمل چسبیدن اسید امینه است و یک حلقه اضافی است .
شکل 3- RNA پیام بر یا mRNA نوعی از RNA است که واسطه ایجاد پروتئین از ژن است .
در طی مراحل نسخه برداری در داخل هسته سلول mRNA بوجود می اید و سپس از هسته سلول خارج شده و در سیتوپلاسم در طی مراحل که ترجمه نامیده می وشد پروتئین ساخته می شود .
بنابراین هر بار که نسخه برداری در ژن انجام می شود یک mRNA تشکیل شده و بعد از انکه وظیفه خود را در سیتوپلاسم انجام داد از بین می رود .
پس ناپایدار است .
mRNA قبل از ترجمه تغییراتی رویش انجام می شود که قبل از ترک هسته در mRNA صورت می گیرد .
تغییراتی در دو انتهای مولکول بوجود می اید .
قسمتهای اینترون جدا شده واکسونها بهم اتصال می یابد .
در بعضی موارد خاص در نوکلئوتیدهای mRNA تغییراتی پیدا می شود و منجر به تشکیل Editiong RNA می شود .
Editing RNA : تغییراتی در بعضی از نوکلئوتیدهای mRNA بوجود می اید به این ترتیب که نوکلئوتیدهای جدید به ان اضافه شده و یا برخی از نوکلئوتیدهای ان حذف می شوند.
اسیدهای امینه یا کدون کلا 20 نوع اسید امینه در انسان وجود دارد که از یک اتم کربن مرکزی ( a) و چهار بازو تشکیل شده است : 1- اتم هیدروژن 2- گروه کربوکسیل ( -Coo- ) 3- گروه آمینو ( -NH3+ ) 4- گروه R گروه R مشخص کننده هر اسید امینه بخصوص است و ساختمان مختلف خواهند داشت .
خصوصیت هر زنجیره پلی پپتید بستگی به اسید امینه های موجود در ان دارد کوفود از راه نسخه برداری ژن و سپس ترجمه mRNA تعیین می شود .
و هر ژن زنجیره پلی پپتید بخصوصی را ایجاد می کند .
شکل کدهای ژنتیکی اسیدهای امینه این کدها در زنجیره های mRNA قرار دارند و این که ون ها در زنجیره DNA تغییر می یابند .
یعنی بجای باز او را سیل باز تخمین قرار می گیرد .
شکل تمام اسید امینه ها غیر از سیستونین و تریتپوفان بیش از یک کد ون دارند .
کدونهای UAA و UAG و UGA هیچ نوع اسید امینه ای را که نمی کنند و کدونها انتهایی هستند .
کدون AUG علامت شروع ترجمه هر کدون ابتدایی است و فقط اسید امینه میتونین را رمز می کند .
البته در طی ادامه زنجیره نیز ممکنست اسید امینه میتونین در ساختمانهیا وسطی پلی پپتید وجود داشته باشد .
نمای انواع نوکلئوتیدها شکل ترجمه Translation اخرین مرحله تظاهر ژن است که در ان ریبوزوم ، mRNA , tRNA نقش اساسی دارند اخرین قدم ساخت زنجیره ای پلی پپتیدی است .
بیست نوع اسید امینه وجود دارد و هر tRNA مخصوص یک اسید امینه خاص خود می باشد .
مثلا tRNA tyr مخصوص اسید امینه تیروزین بوده و به اسید امینه دیگر اتصال نمی یابد .
اکثر اسید امینه ها بیش از یک کدون دارند و برای هر اسید امینه بیش از یک نوع tRNA وجود خواهد داشت .
دو tRNA که به یک اسید امینه اختصاص دارند Isoaxxeptors نامیده می وشد .
هر اسید امینه توسط بازوی که بوکسیل به بازوی دریافت کننده موجود در tRNA می چسبد .
گروهی از انزیمها بنام امینواسیل – tRNA سنتتاز این عمل را کاتالیزوری می کنند .
بعد از انکه عمل شناسایی و اتصال tRNA به اسید امینه انجام گرفت این مجموعه به طرف mRNA حمل شده و ناحیه انتی کدون tRNA به ناحیه کدون مخصوص به همان آنتی کدون که در mRNA است متصل می شود.
مرحله اغاز ترجمه: ربوزومها در پروکاریوتها از دو جز بنامهای 305 و 505 تشکیل می شوند که این دو جزء از هم جدا می شوند .
که فاکتورهایی از جنس پروتئین بنام IF یا Initiation factors مسئول این جدایی هستند .
حال که 305 از مولکول ربوزوم جدا شده به ناحیه Upstream اولین کدون در mRNA می چسبد .
این جمل از نوکلئوتیدهایی تشکیل یافته که از محل اولین کدون واقع در mRNA حدود ده نوکلئوتید فاصله دراد که بنام شاین دالگارنو نامیده می شود .
پس از انکه 305 به mRNA اتصال یافت به طرف اولین کدون در mRNA حرکت می کند در محل اوین کدون که معمولا ANG است ترجمه اغاز می شود .
به این صورت که tRNA با اتصال به اسید امینه مخصوص خود به این محل می رسد و در نتیجه کدون و انتی کدون در مقابل هم قرار می گیرند .
ادامه ترجمه و تشکیل زنجیره پلی پپتید اکنون در اولین کدون mRNA مجموعه ای وجود دارد مرکب از 305 ، 505 و tRNA بهمراه اولین اسید امینه دو منطقه مشخص روی mRNA وجود دارد : منطقه سخت عبارت است از اولین کدون که بنام p.site و منطقه بعدی عبارتست از دومین کدون بنام A.site « منطقه سخت عبارت است از اولین کدون که بنام p.site و منطقه بعدی عبارتست از دومین کدون بنام A.site « منطقه نخست بوسیله اولین tRNA به همراه اسید امینه خود اشغال شده تا مطابقت کدون و انتی کدون mRNA و انتی کدون tRNA انجام پذیرد و منطقه بعدی برای پذیرش دومین tRNA به همراه اسید امینه خود اماده می گردد .
و اتصال بین پیوندهای ایجاد شده بین بازهای کدون mRNA و انتی کدون tRNA خواهد بود .
برای تحقیق این امر فاکتورهای EF یا Elongation factors وارد عمل می شوند .
پایان ترجمه کدونهای پایانی یعنی UAA ، UAG و UGA مسئولیت پایان ترجمه را بعهده دارند .
فاکتور ها یا بنام RF یا Release factorsوارد صحنه می شوند .
که وارد منطقه A.Site شده و باعث رها شدن اخرین tRNA از اخرین اسید امینه می شوند .
سپس ریبوزوم از mRNA و زنجیره پلی پپتید رها شده و بدنبال ان دو جزء ان یعنی 305 و 505 از هم جدا می شوند .
زنجیره های پلی پپتیدی بعد از ساخته شدن ممکنست با اضافه شدن بعضی از مولکولهای شیمیایی به انها و یا کوتاه و بلند شدن طول زنجیره تغییراتی مطابق با نیاز سلولها پیدا کنند .
شکل پروتئینها از مجموعه اسیدهای امینه که تشکیل می یابند بر حسب اعمالی که در سلول انجام میدهند به دستجات زیر تقسیم می شوند پروتئینهای ساختمانی پروتئینهای که در بافتهای حرکتی وجود دارند پروتئینهای انزیمی پروتئینهای حامل پروتئینهای تنظیم کننده پروتئینهای دفاعی پروتئینهای ذخیره ای CDNA نوکلون کردن ژن کلون کردن ژن را می توان بعنوان جداسازی یک توالی ژنی منفرد و ازدیاد ان از طریق جا سازی در یک باکتری که امکان تکثیر ان را فراهم می نماید تعریف نمود .
باکلون کردن یک قطعه DNA امکان بدست اوردن نسخه های بسیار زیادی از مولکول اولیه فراهم می شود .
فراورده حاصل بعنوان DNA نوترکیب تعریف می شود .
مراحل اصلی فرایند کلون کردن ژن ژن مورد نظر جدا سازی می شود.
قطعه ای از DNA که قرار است کلون شود به درون یک مولکول DNA ی کوچک که قابلیت همانند سازی دارد و ناقل نامیده می شود جا سازی می شود .
ناقل می تواند یک پلاسمید یک کاسمید یک ویروس و ...
باشد .
ناقل نوترکیب از طریق ترانسفور ماسیون به درون یک سلول میزبان فرستاده می شود .
سلولهایی که مولکول DNA ی نو ترکیب را دریافت نموده اند .
انتخاب می شوند .
برای تولید تعداد زیادی نسخه کاملا مشابه از ژن کلون شده مولکول DNA ی نو ترکیب در داخل سلول میزبان تکثیر می شود .
کتابخانه های ژنی : برای کلون کردن یک توالی DNA که فراورده ژنی مورد نیاز را کد می نماید باید ان ژن از موجود جدا و در یک مولکول ناقل کلون شود .
کتابخانه هایی از این قطعات کون شده ساخته می شود .
کتابخانه ژنی یک گونه مجموعه ای است تصادفی از قطعات DNA ی کلون شده در یک ناقل مناسب که تمامی اطلاعات ژنتیکی ان گونه را در بر می گیرد .
دو روش برای ساختن کتابخانه ژنی وجود دارد که تحت نام کتابخانه DNA ژنومی و کتابخانه CDNA یا DNA مکمل شناخته می شوند .
کلون کردن قطعات DNA حاصل از CDNA و DNA ژنومی تحت عناوین کلون کردن CDNA و کلون کردن DNA ژنومی بحث می شوند .
کتابخانه های DNA ی مکمل ( CDNA ) و کلون کردن ژن در بسیاری از گیاهان و جانوران تعداد کلونهای کتابخانه ژنومی کامل انقدر زیاد است که شناسایی ژن مورد نظر کار سختی است .
کتابخانه های CDNA زمانی مورد استفاده قرار می گیرند که معلوم باشد ژن مورد نظر در یک نوع سلول یا بافت خاص بیان می شود .
از انجا که همه ژنها در یک زمان بیان نمی شوند به تعدادنسبتا کمی کلون برای ساختن یک کتابخانه CDNA که دارای رونوشتهایی از تمام ژنهای فعال در سلول یا بافتی که mRNA از ان استخراج می شود .
نیاز است .
گزینش در یک کتابخانه CDNA برای شناسایی کلونی که ناقل یک ژن خاص باشد کار نسبتا اسانی است .
mRNA نمی تواند به یک ناقل کلوئینک متصل شود اما می توان با شتن CDNA ، انرا به DNA تبدیل و سپس در یک ناقل مناسب کلون کرد .
شکل راهکار کلون کردن CDNA شامل تهیه رونوشت های DNA از نسخه های mRNA و جا دادن قطعات DNA ی حاصل در پلاسمیدهای باکتریایی و قرار دادن انها در باکتریهای میزبان با استفاده از کلونینگ می باشد .
با توجه داشت که mRNA مورد استفاده برای تهیه CDNA کی نسخه پردازش شده باشد نه یک نسخه اولیه از DNA.
نسخه mRNA اولیه حاصل از رونویسی DNA در یوکاریوتها را RNA ی هسته ای ناهمگن می نامند .
که در درون هسته قبل از وارد شدن به سیستوپلاسم و ترجمه شدن تحت چند مرحله تغییر و تبدیل قرار می گیرند که این مراحل عبارتند از : اضافه شدن یک ساختار کلاهکی به انتهای 5/ پلیمریزه شدن یک زنجیره پلی A به انتهای 3/ و حذف اینتروتها که هرماه بقیه ژن رونویسی می شوند.
انزیم های اندونوکلئاز مولکول mRNA را بصورت اختصاصی برش داده و سپس مناطق اگزون را به هم متصل می کند و یک توالی که کننده پیوسته تشکیل می گردد .
پس از تکمیل مراحل ویرایش مولکول mRNA بالغ به درون سیتوپلاسم منتقل و در فرایند سنتز پروتئین شرکت می کند .
سنتز اولین رشته CDNA با استفاده از DNA پلیمبر از وابسته به RNA که به نسخه برداری معکوس یا Rererse Transcriptase نیز معروف است اولین رشته DNA بصورت تک رشته ای از روی RNA تلخیص شده نسخه برداری می شود .
این انزیم نیز مانند دیگر انزیمهای DNA پلیمراز فقط نوکلئوتیدها را به گروه OH انتهای 3/ یک اغاز گر که از قبل با رشته الگو جفت شده متصل می نماید .
رایج ترین اغاز گر برای ساختن CDNA ها یک الیگو – JT به طول 12-18 نوکلئوتید است که با قطعه پلی A در انتهای 3/ مولکولهای mRNA جفت می شود .
سنتز دومین رشته CDNA دومین رشته CDNA به روش خود اغازگری یا Self priming هیبرید mRNA-CDNA بدست امده واسرشت می شود بنحوی که یک رشته دوم بتواند بر روی CDNA تک رشته ای توسط قطعه کلئو DNA پلیمراز I که خود اغاز گر است ساخته شود .
شکل کلون کردن CDNA متداولترین روش مورد استفاده برای کلون کردن مولکولهای CDNA افزودن قطعات هموپلیمری مکمل به CDNA و پلاسمید ناقل است .
با استفاده از انزیم ترانسفر از انتهایی یک ردیف از نوکلئوتیدهای سیتوزین به هر یک از دو انتهای CDNA 3/ افزوده می گردد که نتیجه این عمل تشکیل دنباله های الیگو – JC در دو انتهاست .
بعد یک پلاسمید نیز در مکان برشی مشخص و ویژه برش داده می شود و دو دنباله الیگو – JC به دو انتهای 3/ آن افزوده می شود .
سپس با تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین هموپلیمرهای مکمل مولکول ناقل و CDNA دو رشته ای به یکدیگر متصل می شوند .
حاصل این اتصال یک مولکول هیبرید حلقوی باز با قابلیت تر از ریخت کردن Ecoli می باشد .
شناسایی و تجزیه و تحلیل ژن های کلون شده پس از کلونینگ ژن DNA ی کلون شده برای دستیابی به اطلاعاتی در مورد ساختمان و کارکرد ژن مرود بررسی و تجزیه و تحلیل قرار می گیرد .
و از روشهای متعددی استفاده می وشد .
که اغلب بر مبنای تکنیک هیبریداسیون با کاوشگرها می باشند .
کاوشگر یا پروب ها هیبریداسیون اسید نوکلئیک در کلون کردن مولکولی یک ابزار بنیادی است .
در واقع همه جنبه های کلونینگ توصیف ساختار و تحلیل و بررسی ژنها مستلزم هیبریداسیون یک رشته اسید نوکلئیک به رشته دیگر است .
بدین جهت از کاوشگرها استفاده می شود .
پروب یا کاوشگر قطعه ای از یک مولکول DNA یا RNA است که توالی مکمل خود را در مولکولهای DNA و RNA تشخیص داده و به ان متصل می گردد .
با استفاده از این هیبریداسیون مولکولی ، امکان شناسایی و جدا سازی توالی های خاص DNA و RNA از یک موجود فراهم می شود .
در عمل ماهیت یک کاوشگر بر مبنای اطلاعات موجود از توالی ژن مورد نظر تعیین می گردد.
روشهای شناسایی ژنها هیبریداسیون کلنی ها یا پلاسما اشکار سازی ایمیونولوژیکی تحلیل ژنهای کلون شده به روش سادرن پلات و ...
روش سادرن بلات DNA ی ژنومی با یک یا چند انزیم برشی هضم شده و قطعات برش یافته با استفاده از الکتروفورز در یک ژل اگارز بر اساس اندازه تفکیک می شوند .
سپس DNA را در ژل و ناتوره نموده و از ژل به یک غشاء منتقل می کنند .
قطعات از طریق انتقال موئینگی از ژل به غشاء منتقل می شوند .
بدین ترتیب که از ژل به درون یک جریان مایع انتقال یافته و به سطح جامد غشاء رسوب داده می شوند .
فاز مایع در اثر موئینگی از درون ژل کشیده می شوند .
این مکش توسط چند لایه دستمال کاغذی خشک و جاذب الرطوبه ایجاد می گردد .
برای این منظور یک صفحه شیشه ای را بر روی تکیه گاهی که در یک تانک قرار گرفته است قرار داده و با استفاده از دولایه کاغذ صافی 3 mm واتمن به گونه ای می پوشانند که کاغذهای صافی از همه جوانب با بافر درون تانک تماس داشته و مانند یک فتیله عمل می کند .
پس از انجام الکتروفورز و اماده شدن ژل انرا دناتوره نموده و بر روی صفحه شیشه ای که توسط کاغذهای صافی پوشیده شده است قرار می دهند .
پس از گذاشتن 2-4 کاغذ صافی بر روی ژل قطعه ای غشاء نایلونی که اندازه ان کمی برگتر از ژل است بر روی ان قرار داده می شود .
توده هایی چند لایه از دستملا کاغذی به ضخامت 10 سانتی متر و به ابعادی برابر با غشاء نایلونی در بخش فوقانی هرم قرار می گیرد و پس از قرار دادن یک صفحه شیشه ای وزنه ای 500 گرمی بر روی ان گذاشته می شود .
نوارهایی از یک پوشش پلاستیکی در اطراف ژل قرار می دهند تا از تماس مستقیم بین توده دستمال کاغذی و فتیله ممانعت گردد .
حداقل زمان لازم برای انتقال 12 ساعت است پس از تفکیک قطعات برشی DNA با استفاده از الکتروفورز در ژل اگارز می توان ان ها را از ژل بر سطح یک غشاء نیتروسلولزی منتقل کرد و پس از هیبریداسیون با کاوشگر مکمل بصورت باندهای کاملا مجزا شناسایی نمود .
روش معادل سادرن بلات که در مورد مولکولهای RNA به کار می رود نورتون بلات است .