دانلود مقاله واکسن و سرم سازی

واکسن و سرم سازی
مقدمه:
در موسسه واکسن و سرم سازی رازی آزمون های مختلفی جهت تعیین سلامت و ایمنی سرمهای درمانی تصفیه شده و ارزیابی دقیق عیار سرمها انجام می دهند که این آزمون ها به طور کلی به دو گروه فیزیکوشیمیایی و بیولوژیکی تقسیم می شوند.

آزمون های گروه اول شامل: اندازه گیری PH، وزن خشک، نیتروژن پروتئین (به دو روش کجلدال و بیوره) و غیره می باشد.

آزمون های گروه دوم شامل: آزمون پیروژنی، سلامت و ایمنی، پوتنسی و غیره می باشد.

در این بخش ما به دلیل مقایسه نمونه به دست آمده و تصفیه شده توسط دستگاه دیالیز با نمونه ای که موسسه به روش سنتی دیالیز می کند آزمون های فوق را در شرایطی یکسان برای هر دو نمونه انجام دادیم و نتایج را با هم مقایسه کردیم که پاره ای از این آزمون ها و نحوه اجرای آنها را شرح داده ایم.

به دلیل اینکه آزمون های گروه اول (فیزیکو شیمیایی) در حوصله این پایان نامه و موضوع ارائه شده است لذا به ذکر این آزمون ها و نحوه اجرای آنها بسنده شده است و آزمون های گروه دوم که بیشتر جنبه پزشکی دارند را فقط به ذکر یکی از آنها که پوتنسی می باشد اکتفا کرده‌ایم.

غلظت یون هیدروژن PH:
غلظت یون هیدروژن با پارامتر PH بیان می گردد و در همه موارد به کمک PH متر الکترونیکی اندازه گیری می شود.

لازم به ذکر است که حدود قابل قبول PH برای سرمهای درمانی 2/7-4/6 می باشد.

وزن خشک: Total Solid
اساس آزمایش بر پایه قرار دادن 1 میلی‌لیتر سرم در شرایط خلاء درون آون در دمای 37 برای مدت 24 ساعت و سپس توزین آن می باشد.

نتیروژن پروتئین: (به روش کجلدال) Protein Nitrogen Content
نیتروژن در مواد گوناگون تحقیقاتی، صنعتی، کشاورزی یافت می شود.

مثلا این عنصر را می‌توان در آمینواسیدها، پروتئین ها، داروهای سنتزی، کودها، مواد منفجره، خاکها، آبهای آشامیدنی و رنگها یافت.

بنابراین روش های تجزیه ای برای تعیین نیتروژن خصوصاً در مواد آلی از اهمیت زیادی برخوردارند.

معمولترین روش برای تعیین نیتروژن مواد آلی، روش کجلدال است.

این روش بر پایه تتراسیونهای خنثی شدن استوار است.

این روش، روشی ساده بوده و به تجهیزات خاصی نیاز ندارد و نیز می توان آن را به سهولت برای تجزیه معمولی تعداد زیادی نمونه به کار برد.

روش کجلدال، روش استانداردی برای تعیین مقدار نیتروژن در پروتئین، غلات، گوشت و سایر مواد زیستی است، چون پروتئین ها تقریباً حاوی درصد یکسانی از نیتروژن هستند، لذا با ضرب این درصد در یک عامل مناسب (25/6 برای گوشتها، 38/6 برای لبنیات، 7/5 برای حبوبات) می توان درصد پروتئین نمونه را به دست آورد.

این آزمایش روی نمونه های پلاسما و فرآورده نهایی به روش کجلدال انجام شده و مقدار نیتروژن نمونه به دست می آید.

این آزمایش روی نمونه های پلاسما و فرآورده نهایی به روش کجلدال انجام شده و میزان نیتروژن نمونه به دست می آید.

از آنجا که هر یک میلی گرم نیتروژن از 25/6 میلی‌گرم پروتئین فراهم می شود.

پس از اندازه گیری نیتروژن پروتئین می توان مقدار پروتئین را معلوم نمود.

در این روش 1 نمونه سرم ضد مار یا عقرب را برداشته و آن را با 17 سرم فیزیولوژی (کلرور سدیم) 2 تری کلرواستیک 100% مخلوط کرده و درون یک لوله آزمایش ریخته و برای مدت 15 دقیقه با آژیناتور با فاصله به هم می زنیم.

بعد آن را درون دستگاه سانتریفیوژ قرار می دهیم با دور 2000 دور در دقیقه‌ برای مدت 15 دقیقه، تا رسوب آن کاملا ته نشین شود بعد رسوب را با چند قطره سود 40% یا 10 نرمال حل کرده و در یک بالن ژوژه 25 ریخته و با آب مقطر آن را به حجم می رسانیم.

بعد 2 از این محلول را در فیول ریخته و به آن 6 از محلول منیرالیزاتور می افزاییم.

سپس فیولها را درون زنبیل گذاشته و روی هیتر قرار می دهیم.

برای مدت 2 تا 3 روز در روی هیتر می ماند.

اول به رنگ تیره در می آید و بعد هنگامی که به رنگ سبز تبدیل شد آن را بر می داریم (به صورت سبز غلیظ) بعد این محلول غلیظ سبز رنگ را برداشته و درون یک ارلن می ریزیم و به آن 8 محلول NaOH، 40% اضافه می نماییم که در این حالت ازت به آمونیاک تبدیل می شود.

درون یک بشر 100 ، ما 10 اسید بوریک 2% می ریزیم و 3-2 قطره اندیکاتور به آن می افزاییم و می گذاریم تا بماند و سپس این محلول را قطره قطره به درون ارلن اضافه کرده تا به حجم 80 برسد و بعد توسط اسید سولفوریک تیتر کرده تا به رنگ صورتی تبدیل شود.

و از روی میزان مصرف اسید طبق فرمول زیر می توان میزان ازت را به دست آورد که اگر در 25/6 ضرب شود میزان پروتئین به دست می آید.

T: میزان شاهداست (هرسانتی متر مکعب ، با حدود 0.2 gr ازت ترکیب می شود و سولفات آمونیوم می دهد) x: میزان اسید مصرفی در زمان تیتراسیون Total protein= N.P * 6.25 به عنوان مثال اگر ما محلولی را با 4 مصرف اسید سولفوریک تیتر نماییم میزان کل پروتئین به صورت زیر محاسبه می شود.

Total protein= 9.5 * 6.25 = 59.375 طرز تهیه محلول منیرالیزاتور: 105gr سولفات پتاسیم به اضافه 6gr سولفات مس را با هم مخلوط کرده و 150 اسید سولفوریک غلیظ را به آهستگی به آن افزوده و سپس آنها با آب مقطر به حجم 900 می رسانیم.

طرز تهیه اندیکاتور: 83mgr برموکروزول را با 17mgr متیل قرمز مخلوط کرده و با الکل 96% به حجم 100 می رسانیم.

روش کجلدال به حضور سولفات آمونیوم حساس است.

لذا نمونه ها باید فاقد سولفات آمونیوم باشد که این کیفیت با آزمایش کلرور باریم قابل بررسی است.

آزمون کلرور باریم جهت بررسی سولفات آمونیوم: هدف این آزمایش تأیید عدم حضور مقادیر قابل توجه سولفات‌ آمونیوم پس از دیالیز است.

به عبارت دیگر کامل بودن دیالیز با منفی بودن نتیجه این آزمایش معلوم می شود.

انجام این آزمایش از آنجا که غلظت پروتئین یا نیتروژن پروتئین ‎فرآورده نهایی تصفیه به روش بیوره یا کجلدال انجام می گیرد و هر دو روش به حضور یون آمونیوم حساس هستند حائز اهمیت است.

نتیجه آزمایش مذکور اگر منفی باشد نشانه حضور مقادیر بسیار ناچیز یون آمونیوم (حدود چند میکروگرم در لیتر) در نمونه است.

روش کار بدین صورت است که 1ml از نمونه محلول حاصل دیالیز و در لوله آزمایش ریخته و به آن 8ml سرم فیزیولوژی و 1 ml کلرو باریم 10% اضافه می شود.

اگر محلول حاصل کدر شود نشانه ایجاد رسوب BaSO4 است و در غیر این صورت اگر محلول شفاف بود می توان نتیجه می گرفت که غلظت یون سولفات در نمونه بسیار ناچیز و کمتر از mg/Lit4 است.

(این مقدار با توجه به ثابت حاصلضرب حلالیت سولفات باریم محاسبه گردیده است که چیزی در حدود ( است) در این شرایط غلظت یون آمونیوم نمی تواند خطای قابل ملاحظه ای در سنجش غلظت پروتئین با روش های بیوره یا کجلدال ایجاد نماید.

تعیین غلظت پروتئین به روش بیوره: Biuret Method اساس این روش مبتنی بر این واقعیت است که در یک محیط قلیایی املاح مس دو ظرفیتی (Cu2+) می توانند با بیوره کمپلکس رنگی ایجاد کنند.

چنین واکنشی با کلیه مواد پروتئینی که حداقل دارای دو پیوند پپتیدی هستند نیز قابل اجرا است.

این محلول عبارت است از محلول سولفات مس در یک قلیای قوی، که رنگ آبی- ارغوانی این محلول به اطلاعاتی در مورد عدد کئوردیناسیون کمپلکس بستگی دارد.

بین Cu2+ و چهار اتم نیتروژن دو پپتید یک همسایگی و مجاورت وجود می آید.

دی پپتیدها و اسیدهای آمینه آزاد نمی توانند این واکنش را صورت دهند.

این صفحه برای رسم واکنش ها است.

کمپلکس حاصل بیشترین جذب را در طول موج nm560-540 دارد.

غلظت کمپلکس حاصل با افزایش غلظت پروتئین بیشتر شده و مناسب با آن شدت جذب در این طول موج افزایش می یابد.

بدین ترتیب به کمک اسپکتروفتومتری جذبی در طول موج nm560-540 غلظت پروتئین محلول در نمونه تخمین زده می شود.

واکنشگر بیوره محلولی است محتوی gr5/1 سولفات مس (CuSO4-5H2O) و gr6 سدیم پتاسیم تارتارات در ml300 محلول () 15% هیدروکسید به آن اضافه شده و حجم آن با آب به 1 lit افزایش می یابد.

برای ذخیره سازی طولانی مدت و حفظ قدرت واکنشگر، 1gr یدید پتاسیم به آن افزوده شده و در ظرف پلاستیکی و در محل تاریک و سرد (8) نگهداری می شود.

نحوه آزمایش به این صورت است که: ما یک نمونه Blank می سازیم که محتوی ml5/0 سرم فیزیولوژی و ml5/2 محلول بیوره است و با این نمونه نخست دستگاه را تنظیم کرده (صفر می نماییم) البته قبل از این کار نمونه را برای مدت 15 دقیقه در دمای 37 قرار می دهیم.

سپس در 8 لوله آزمایش نمونه های زیر را می سازیم.

و برای مدت 15 دقیقه در دمای 37 درون آن قرار می دهیم.

بعد با نمونه اول که آن هم یک نمونه Blank است دستگاه UV را که در nm 540 جذب، تنظیم شده صفر می نماییم.

سپس لوله های 2 تا 8 را یکی پس از دیگری درون دستگاه قرار می دهیم و جذبشان را می خوانیم و در دستگاه ثبت می نماییم و نمودار گراف آن را رسم می نماییم که اگر به صورت یک خط راست بود، نمونه های ما قابل قبول هستند و بعد نمونه سرم اصلی را درون دستگاه قرار داده و آن نمونه را آنقدر رقیق کرده که جذبش در روی خط راست قرار می گیرد.

(در محدوده جذب باشد) بعد عدد جذب نشان داده شده را در مقداری که رقیق کرده ایم ضرب کرده و میزان پروتئین حاصل به دست می آید.

روش دیگری هم وجود دارد که به صورت زیر می باشد.

سه لوله آزمایش مطابق زیر آماده می شود.

لوله شماره 1 (Test): محتوی ml5/0 نمونه مورد آزمایش به علاوه ml5/2 واکنشگر بیوره لوله شماره 2 (Standard): محتوی ml5/0 از محلول پروتئین استاندارد (mg/ml6) به علاوه ml5/2 واکنشگر بیوره.

لوله شماره 3 (Blank): محتوی ml5/0 سرم فیزیولوژی بعلاوه ml5/2 واکشنگر بیوره تمامی لوله ها را در دمای 37 برای مدت 30 دقیقه قرار می دهیم.

ابتدا دستگاه اسپکتروفتومتر را با بلانک صفر کرده و سپس میزان جذب لوله های 1 و 2 در طول موج nm560-540 اندازه گیری می شود.

برای محاسبه غلظت پروتئین از رابطه: به دست می آید.

غلظت پروتئین نمونه مورد آزمایش به روش بیوره (حساسیت روش بیوره mg/ml 6-1) هنگامی به مقدار واقعی نزدیک است که بین mg/ml 6-1 باشد، در غیر این صورت می توان با غلیظ کردن، غلظت آن را در حدود دامنه مذکور قرار داد.

آزمون پوتنسی: Potency این آزمایش به منظور تعیین قدرت سرمهای درمانی ضد سم در خنثی سازی سم صورت می‌گیرد.

هنگامی که مقدار معینی سم استاندارد، با رقتهای مختلف سرم ضد سم مخلوط شود و به حیوان تزریق گردد.

واکنش بدن حیوانات در برابر سم با بعضی رقتهای ضد سم سرکوب می شود.

بدین ترتیب حداقل مقدار سرم ضد سم برای خنثی کردن اثر سم تعیین می شود.

اساس این آزمایش بدین صورت است که تعدادی موش را انتخاب کرده و آنها را برای تزریق سم آماده می نماییم.

دزهای مختلفی از سم را درست کرده و سپس آن را به بدن حیوان همراه با پادزهر تزریق کرده و به حال خود می گذاریم و پس از این مدت به سراغ موش ها رفته و تعداد تلفات را مشاهده کرده و حداقل دزی را که سرم توانسته سم را خنثی نماید مشخص می نماییم.

بدین ترتیب که دزهای …….0.3 , 0.2 , 0.1 عمل تزریق صورت می گیرد که نحوه تهیه سم به صورت زیر است.

برای سم 0.1، ما به میزان 0.1 ml سم مار را به حجم 1 می رسانیم و بعد 1 سرم فیزیولوژی به آن می افزاییم و سپس عمل تزریق را انجام می دهیم که به هر موش 0.5 از ناحیه رگ دم موش تزریق می شود.

هر دز را به سه عدد موش تزریق می کنیم که در صورتی که حداقل 2 موش سالم باشند سرم ضد مار توانسته آن دز را خنثی نماید و قابل قبول است.

برای اینکه در قفس دزها با هم قاطی نشوند و بتوان فهمید که کدام موش چه دزی بهش تزریق شده است.

موش ها را رنگ کرده تا با هم قاطی نشوند، هر دز یک رنگ می شود.

این آزمون موید تاثیر درمانی سرم ضد سم در غلظت های درمانی است.

87654321Additions (ml)1.21.00.80-60.40.20.1-Standard BSA (2mg/ml)0.30.50.70.91.11.31.41.5H2O (deionized)1.51.51.51.51.51.51.51.5Biuret reagent 6*مقدار جذب لوله شماره 1= غلظت پروتئین نمونه مورد آزمایش6*مقدار جذب لوله شماره 2= غلظت پروتئین نمونه مورد آزمایش