دانلود تحقیق کشت بافت

خلاصه مراحل پیشرفت کشت بافت
1.totipotency (شوال وشیلیدن)
اولین بار در سال 1838 بیان شد.توانایی یک سلول گیاهی برای تولید یک گیاه کامل که از طریق کشت بافت می توان،سلول گیاهی را به یک گیاه کامل تبدیل کرد وهر سلول گیاهی مستقل عمل میکند.
2.در سال1902_(هابرلانت) نتوانست از طریق کشت بافت گیاهی،گیاه کامل را بوجود اورد.
3.در سال1939_نوبکرات،توانست از طریق کشت بافت گیاهی،گیاه کامل را بوجود اورد.
4.در سال1970_پیشرفت زیادی داشت
5.از سال 1970 به بعد هورمونهای گیاهی کشت شدند.با این هورمونها کشت را به طور پیچیده تر توانستند انجام دهند.
6.در سال1985_از طریق کشت بافت 70میلیون گیاه از طریق کشت بافت در فرانسه تولید شد
انواع کشت بافت
1.کشت بذر_بعضی بذرها آندوسپرم ندارند(ارکیدها) جوانه زنی آنها به صورت طبیعی بر روی قارچ است.اگر بذرها را درمحیط آگار قرار دهیم جوانه می زنند.
2.کشت جنین_جنین از بذر جدا ومستقیم به محیط کشت می برند به این خاطر زمانی که رکورد مکانیکی داریم ویا اینکه مواد بازدارنده در آن وجود داشته باشد.
3.کشت اندام های گیاهی یا کشت مریستم انتهایی_قسمت انتهایی که جدیدتر از گیاه جدا کرده وبه روی محیط کشت یک گیاه کامل بوجد اوریم مثل قلمه گیری
4.کشت کالوس_توده سلولی تمایز نیافته را گویند.اندام گیاهی را وادار به تولید گیاهی کنیم.با تنظیم هورمونهای گیاهی که بعد سلولهای کالوس را جدا کرده وبر روی محیط کشت قرار می دهند.
5.کشت سلول_توسط آنزیم هایی که دیواره را هضم می کنند و با توسط روشهای مکانیکی می توانیم سلوها را از هم جدا کنیم.
6.کشت پروتوپلاست_دیواره سلولی را جدا وباقیمانده آن را در محیط کشت پرورش می دهند.
دی فوسارد سه نوع کشت بافت یا کشت درون شیشه ای invitroرا در سال 1977 بیان کرد
1.سازمان یافته_از بذر،اندام های گیاهی استفاده می شود.(ثبات ژنتیکی بالایی دارد)
2.سازمان نیافته_سلولهای کالوس را جدا کرده و بهشکل توده ای استفاده می کندو(ثبات ژنتیکی پایینی دارد)
3.حد واسط_اندام های گیاهی را جدا کرده ومحیط کشت را طوری تنظیم کرده که کالوس بوجود آید وبعد کالوس جدید را در محیط گذاشته(ثبات ژنتیکی حد واسط دارد)




کشت بافت
به کشت سلول های ایزوله،بافت واندام های گیاهی بر روی محیط کشت وشرایط invitro در داخل لوله ازمایش،پتریدیش یا ظروف مناسب دیگر وعاری از هر گونه میکروارگانیسم،کشت بافت گیاهی اطلاق می شود.امروزه کشت بافت گیاهی از اهمیت بسیار زیادی برخوردار است.ودر سطح وسیعی از ان استفاده می شود.
کشت بافت عبارت است از کشت یاخته،پروتوپلاست واندام های گیاهی در شرایط گندزدائی شده در محیط غذایی مصنوعی داخل شیشه است.اکنون این فناوری به عنوان یک روش پایه ای ویک ابزار محوری بسیار عالی در تکثیر واصلاح نژاد گونه های گیاهی مهم اقتصادی موقعیت ویژه ای را کسب کرده است.
تولید غیر جنسی به روش کشت بافت را ریزازدیادی می گویند.در حال حاضر فناوری ریزازدیادی به طور تجاری با سود بسیار عالی برای تولید میلیون ها نهال هرساله در سراسر جهان مورد بهره برداری قرار می گیرد.ریزازدیادی به علت تولید نهال های یکنواخت در مدت زمان نسبتا کوتاه ودر فضای تقریبا اندک اهمیت اقتصادی فراوان کسب کرده است.
تولید غیر جنسی به روش کشت بافت را ریزازدیادی می گویند.در حال حاضر فناوری ریزازدیادی به طور تجاری با سود بسیار عالی برای تولید میلیون ها نهال هرساله در سراسر جهان مورد بهره برداری قرار می گیرد.ریزازدیادی به علت تولید نهال های یکنواخت در مدت زمان نسبتا کوتاه ودر فضای تقریبا اندک اهمیت اقتصادی فراوان کسب کرده است.

گیاهشناسی پسته تاریخچه پسته گیاهی است که از دیرباز در نقاط مختلف ایران مورد کشت و پرورش قرار می‌گرفته است.

جنگل‍های وحشی و خودروی پسته در ناحیه شمال شرقی ایران و نواحی هم ‍مرز با ترکمنستان و افغانستان پیشینه ای باستانی دارد و تصور می ‍رود که درخت پسته حدود 4-3 هزار سال قبل درایران اهلی شده و مورد کشت وکار قرارگرفته است اولین ارقام پسته در ایران حاصل پرورش و اهلی کردن درختان پسته وحشی بوده است که تعداد این ارقام بسیار محدود و شکل ظاهری آن با محصول پسته خودرو شباهت داشته است.کم کم بر اثر پیوند و جابجائی این ارقام و توجه باغداران از نظر درشتی دانه های پسته تا حدودی تحول ایجاد شده و ارقام جدیدی بوجود آمده است.

ارزش اقتصادی : پسته به عنوان یک محصول استراتژیک جایگاه خاصی را در بین تولیدات دارا می باشد.

این محصول بخش عمده ای از صادرات غیرنفتی را تشکیل می ‍دهد .

درشرایط کنونی حدود 55 درصد از تولید و بیش از 60 درصد از صادرات جهانی پسته در اختیار کشور ما بوده و درآمد ارزی حاصل از صادرات پسته بیش از 400 میلیون دلار می باشد.

گیاه شناسی پسته : درخت پسته اهلی ) (Pistacia Vera L.) متعلق به تیره سماق (Anacardiaceae) است جنس Pistacia دارای 11 گونه است که همگی ‌آ‌نها از خود، تربانتین یا سقز ترشح می ‍کنند.گیاهان این تیره بصورت درخت یا درختچه هستند.

درخت پسته دارای برگ‍های مرکب شانه ای است و هربرگ یک جوانه جانبی را در برمی‍‍گیرد.

اکثر جوانه های جانبی به گل آذین اولیه مبدل می ‍شوند و یک محور اصلی را تشکیل می ‍دهند که در سال بعد خوشه پسته را تولید می کنند.

بنابراین این خوشه های پسته به صورت جانبی بر روی شاخه یکساله می ‍شوند.

از نظر گیاه شناسی میوه پسته در ردیف میوه های شفت طبقه ‍بندی می ‍شود میوه های شفت متشکل از سه قسمت : لایه برون خارجی، لایه میان گوشتی و لایه درون برسخت هستند که درون بر، هسته را می ‍پوشانند.

تفاوت میوه های شفت در بخش خوراکی آنها است.

در پسته و بادام، هسته (مغز) به صورت خوراکی میوجات ‍رسد، در حالی که سایر میوه ‍ شفت (زردآلو، هلو)، هسته سخت دارند و میان برگوشتی بخش خوراکی میوه می باشد.

درخت پسته دو پایه است، یعنی برای تولید میوه به وجود هر دو پایه نر و ماده نیاز می باشد و تشخیص درخت نر و ماده از یکدیگر به جز از روی گل آنها (آن هم در فصل بهار و به هنگام گل دادن ) میسر نیست.

البته کارشناسان و باغداران باتجربه از روی اندازه درخت، شکل برگ‍ها، شکل جوانه ها و نحوه استقرار آنها برروی شاخه ها، درخت نر را از ماده براحتی تشخیص می ‍دهند.

گل ها فاقد گلبرگ و غده های شهد ‍ساز بوده، بنابراین زنبور عسل را به خود جلب نمی ‍کند و گرده گل توسط باد پراکنده می ‍شوند.

درخت پسته برگ ‍ریز است، بدین معنا که در پاییز خزان نموده و زمستان را در خواب می گذراند.

ریشه ‍زائی درخت پسته به ‍صورت محوری و عمودی است و تا عمق بیش از دو متر داخل خاک فرو می ‍رود.

سیستم ریشه ‍زائی عمقی درخت را قادر می سازد تا به اعماق خاک نفوذ کرده و از آب و مواد موجود در آن به خوبی تغذیه نماید و از این رو درختان پسته قابلیت سازش با دورههای طولانی خشکسالی را دارند.

قدرت تولید ریشه فرعی در درخت پسته خیلی ضعیف است و هرگاه انتهای ریشه اصلی قطع شود، درخت خشک شده و از بین می رود.

مرحله نونهالی درخت پسته طولانی است.

تا قبل از پنج سالگی، درختان میوه کمی تولید می کنند و از 10 تا 12 سالگی باردهی کامل و اقتصادی درخت آغاز می شود.

درخت پسته عادت به رشد عمودی دارد، به نحوی که رشد سریع جوانه انتهائی از رشد جوانه های جانبی در درختان مسن‍تر جلوگیری می کند.

این ویژگی‍ها بر نحوه تربیت نهال‍های جوان، هرس درختان بالغ و جوان‍سازی درختان مسن تاثیر زیادی دارد شرایط آب و هوایی مورد نیاز درختان پسته الف- عرض جغرافیایی :کشت و پرورش درختان پسه ایران در عرض 37-27 درجه شمالی می باشد.

ب- ارتفاع از سطح دریا : درختان پسته در ارتفاع 2000-900 متری از سطح دریا قرار گرفته اند.

برای بعضی از گونه ها ارتفاع مناسب 3000-700 متر ذکر شده است.

امروزه کشت وکار پسته در ارتفاعات پایین‍تر (260 متر در شهرستان سرخس تا 40 متر در شهرستان گنبد) انجام گرفته و محصول مناسبی نیز تولید نموده است ج- درجه حرارت : درخت پسته دمای 45 درجه سانتی گراد در تابستان و دمای 20- در زمستان را به خوبی تحمل می‍نماید.

د- رطوبت نسبی : برای داشتن حداکثر محصول، میزان رطوبت نسبی در تابستان بایستی کمتر از 35% باشد، البته وجود مقادیر کمتر رطوبت نسبی نیز توصیه شده است زیرا باعث کاهش بیماری‍های قارچی می‍شود افزایش رطوبت نسبی در زمان گلدهی و گرده‍افشانی باعث بازده گرده‍افشانی و در نتیجه کاهش تشکیل میوه گونه های پسته در ایران : از گونه های جنس Pistacia تنها P.vera (پسته اهلی) P.khinjuk (چاتلانقوش، کسور، گلخونک یا خنجک) و P.mutic (بنه) موجود است.

چاتلانقوش و بنه پایه های مناسبی برای پیوند درختان پسته اهلی به شمار می ‍روند.

P.vera در بین گونه های فوق تنها درختی است که به صورت اهلی درآمده و نوع وحشی آن نیز در جنگل‍های سرخس واقع در منطقه مرزی شمال شرقی کشور یافت می ‍شود.

مشخصات گل نر : درخت نر در فروردین ماه حدود 5 تا 7 روز زودتر از درخت ماده به گل می نشیند که گل‍‍های آن به صورت خوشه ای بوده و هر خوشه، توده ای ازگل‍های متراکم می باشد.

گل‍ها بدون گلبرگ و کاسبرگ حقیقی هستند.

هرگل نر مشتمل بر5 پرچم بیضی شکل با میله کوتاه سبز رنگ است مهمترین ارقام پسته : مهمترین ارقام پسته در ایران عبارتند از : اکبری ، کله قوچی ، احمد آقائی ، اوحدی ، بادامی زرند، ممتاز خنجری دامغان ، شاهپسند سفید پسته نوق و قزوینی .

پسته رقم اکبری : یکی از راقام تجاری پسته است که از نظر اقتصادی دارای بالاترین ارزش می ‍باشد.

میوه‍های آن بادامی شکل،کشیده و درشت هستند .

از خصوصیات این رقم رشد رویشی زیاد آن برگ‍های متراکم، سطح وسیع برگ محصول زیاد، دیر‍گلی و دیررسی بوده که در که در دهه سوم شهریورماه قابل برداشت می ‍باشد.

پسته رقم کله قوچی : درشتی میوه فندقی شکل و عملکرد خوب این رقم سبب شهرت و گسترش آن شده است.

این رقم نسبت به کمبودی آب و مواد غذائی حساس بوده و اکثریت برگ‍های آن مرکب 5 برگچه ای هستند و برگچه انتهائی بزرگ‍تر از برگچه های جانبی می ‍باشد.

رقمی زودگل بوده و به همین دلیل بیشتر در معرض خطر سرمای دیر رس بهاره و خسارت ناشی از آن قرار دارد.

این رقم در دهه دوم شهریور ماه قابل برداشت است و از این نظر جز ارقام متوسط رس می باشد.

پسته رقم احمد آقائی: درشتی میوه بادامی شکل و سفیدی پوست استخوانی این رقم سبب گسترش آن شده است.

اکثریت برگ‍های آن مرکب سه برگچه ای هستند رقمی متوسط گل بوده و در دهه سوم شهریور ماه قابل برداشت است، از این نظر جز ارقام دیررس می ‍باشد.

پسته رقم اوحدی : یکی از گسترده ‍ترین ارقام تجاری پسته کشور محسوب می ‍شود بسیار معروف و سازگار برای اکثر مناطق پسته ‍کاری است که طی 50 سال گذشته احداث شده اند.

اکثریت برگ‍های آن مرکب سه برگچه ای هستند و برگچه انتهائی آن بزرگتر از برگچه های جانبی می ‍باشد.

رقمی متوسط گل بوده و در دهه اول شهریور ماه قابل برداشت است و از این نظر جزارقام زودرس می باشد.

کاربردهای متفرقه کشت بافت 1.بیماری شناسی تولید گیاهان عاری از ویروس وبیماری ها برای بررسی رفتار ویروس در سلول گیاهی چگونگی ورود ویروس،آلودگی وتکثیر القای موتاسیون برای تولید گیاهان مقاوم به بیماری استفاده از اکروباکتریوم برای تولید گیاهان جدید 2.اصلاح نباتات برای تولید گیاهان شیمر(در یک نوع بافت گیاهی چند نوع ژنوتیپ داشته باشیم) تولید گیاهان تری وتتراپلوئیدی روشهای مختلف برای تولید گیاهان پلی پلوئید استفاده از یک ماده طبیعی گیاهی به نام کلشی سینکه برای دو برابر کردن کروموزوم ها است وکلشی سین به گرما حساس است واز فیلتربرای استریل کردن آن استفاده می کند.در تیمارهای طولانی مدت غلظت پایین ودر تیمارهای کوتاه مدت غلظت بالا استفاده می شود.

گاهی اوقات در گیاه بدون استفاده از هیچ ماده مصنوعی تعداد کروموزوم ها دو برابر می شود یعنی در تقسیم میتوز همه ی کروموزوم ها در یک ظرف قرار می گیرند ودوبل می شوند.

استفاده از هیبریداسیون سوماتیکی(رویشی)یعنی سلول های رویشی را با هم هیبرید می کنند.

تولید تری پلوئید:از تلاقی یک دیپلوئید ویک تتراپلوئید بوجود می اید.واگر سلول های آندوسپرم را در محیط کشت قرار دهیم گیاه حاصل تری پلوئید استلب ایزوله کردن موتانت.اگر موتاسیون بسیار کوچک باشد بطور طبیعی از این موتانت نمی توانیم گیاه تولید کنیم اما درشرایط کشت بافت براحتی از سلول موتاسیون یافته جوانه ی نابه جا تولید شده ویک گیاه جدید تولید می شود.

القا موتاسیون نگهداری مواد گیاهی در محیطinvitro _منظور از این مطلب همان بانک ژن است 3.بیوسنتز مواد در شرایط invitro مزایای کشت بافت با توجه به خصوصیات ویژه ریزازدیادی این تکنیک امروز در بیشتر گیاهان باغبانی که ارزش اقتصادی دارند به کار میرود براساس این روش دارای مزایای زیر می باشد.

ازدیاد هم گونه هایی که تکثیر آنها به روشهای غیر جنسی دیگر غیر ممکن یا مشکل باشد به کار می رود.

امکان تکثیر در تمام فصول سال وجود دارد.

تسریع در گلدهی حفظ ونگه داری مواد کیاهی برای مدت طولانی وهمچنین حمل ونقل آنها به مناطق دور دست امکان پذیر شود.

امکان ازدیاددر زمان کوتاهتر وفضای کمتر نسبت به سیستم سنتی وجود دارد.

در این سیستم زمان اصلاح با تولید هیبریدهای رویشی نسبت به سیستم طبیعی واصلاح نباتات سنتی برای درختانی که دوره رویشی طولانی دارند بسیار کوتاه وعملی می شود.

ایجاد گیاهان عاری از امراض به خصوص ویروس را امکانپذیر می شازد.

سازماندهی یک آزمایشگاه که درآن فنون کشت بافت به کار گرفته شود بدون توجه به هدفی خاص باید در برگیرندهای شماری از تسهیلات اولیه باشد.این تسهیلات بخش های زیر را در بهره میگیرد.

جایگاهی برای شستشوی کلی جایگاهی برای تهیه سترون کردن(استریل کردن)ونگهداری محیط کشت جایگاهی گندزدائی شده برای انتقال اتاق های کشت واتاقک های با محیط کنترل شده جایگاهی برای مشاهد وجمع اوری داده ها لوازم ازمایشگاه اجاق ظروف شیشه ای یا فولاد زنگ نزن برای گرم کردن وحل کردن محیط کشت دستگاه سترون کننده با فشار بخار وسایل پخش کننده مواد مایع یخچال مواد شیمیایی برای ساختن محیط کشت انواع کندزداها لوله ها شیشه ها وسایر شیشه الات کشت با سرپوش مناسب ترازوی قابل اندازه گیری تا صدگرم استوانه مدرج گندزدایی خسته کننده ترین بخش فن کشت درون شیشه ای گندزدایی یا سترون کردن موادگیاهی ومحیط های کشت ونگهداری آن ها در شرایط گندزدایی شده می باشد.باکتری ها وقارچ ها دو الودگره مهم بوده که بیشتر در کشت های یاخته ای دیده می شوند.هاگ ها ی قارچ ها سبک وزن بوده وهمه جا حضور دارند،هنگامی که هاگ قارچها در تماس با محیط کشت بافت قرار می گیرد شرایط برای جوانه زنی هاگ ها در پی آن آلودگی محیط بهینه است.

گندزدائی محیط کشت غذایی دوروش،یکی اتوکلاو کردن ودیگری گذراندن از غشاء صافی در فشار مثبت،بطور معمول برای سترون کردن محیط کشت به کار میرود.محیط کشت آب مقطر ودیگر آمیزه های با ثبات می توانند در ظرف های شیشه ای دارای سرپوشی ازپنبه،ورقه آلومینیوم(فویل)اتوکلاو شود.

گندزدائی اتاق های کشت ودستگاه انتقال اتاق های بزرگ انتقال توسط نور فرابنفش گندزدائی می شود.مدت گندزدائی برحسب اندازه اتاق متفاوت است وتنها هنگامی باید انجام شود که هیچ آزمایشی در حال انجام نباشد.

اتاق انتقال باید را می توان با یک تا دو بار شستشو در ماه با یک ماده ضدقارچ وضد باکتری گندزدائی کرد.اتاق های انتقال را کوچکتر ودستگاه هوا با اشعه فرابنفش ویا تیمار با یک باکتری کش یا قارچ کش نیز سترون شوند.دستگاه جریان هوا را می توان به آسانی به وسیله روشن کردن دستگاه وکشیدن پارچه آغشته به الکل اتیلیک 95 درصد به مدت 15 دقیقه پیش از شروع کار در تمام سطوح درون دستگاه گندزدائی کرد.

گندزدائی شیشه آلات وابزارها ابزارهای فلزی،شیشه آلات،فویل های آلومینیوم وغیر را می توان با مواجه کردن با هوای گرم وخشک به مدت 2تا4 ساعت در یک آون هوای گرم سترون کرد.همه چیزهای مورد نظر برای سترون شدن باید پیچیده شوند.نباید از کاغذ برای پیچیدن استفاده کرد.

اتوکلاو برای ابزارهای فلزی توصیه نمی شود.چون ممکن است در چنین شرایطی زنگ زده وکهنه شود.پیش از بکار گیری ابزارهای که توسط آون سترون شده اند بایستی زیر هود باز شوند وبرای استفاده از پنس وچاقو در الکل اتیلیک 95% فرو برد وبا شعله مواجه ساخته.پس از به کار گیری ابزار باید دوباره در الکل اتیلیک 95% فرو برد ودگر بار شعله داده شود.این فن سترون کردن شعله ای نامیده می شود.اتوکلاو کردن یک روش سترون کردن با بخار آب در زیر فشار است.

ظروف شیشه ای،لئازم آزمایشکاهی،پیت ها،آب ومحیط کشت غذایی همگی می توانند با اتوکلاو کردن سترون شوند.تقریبا تمام میکروبها با مواجه ساختن در فشار 5/1atm را به مدت 20 دقیقه کشته شوند.

گندزدائی مواد گیاهی دستیابی به مواد گیاهی سترون مشکل است با وجود احتیاط های لازم 95%از کشت ها در صورتی که ریز نمونه به خوبی گندزدائی نشده باشد به آلودگی می انجامد،از آنجا که مواد زنده را نمی توان با گرمای زیاد مواجه ساخت به گونه ای که فعالیت بیولوژیکی خود را نگهداری اندام ها وبافت های گیاهی را توسط تیمارهای با مواد گندزا سترون می کنند.هنگامی که ریز نمونه ها گرفته شدند.آنها را باید در یک ماده شوینده صابون رقیق به مدت 10 تا 30 دقیقه سترون کرد،شستشو داد.پس از شستشو بافت باید آن را با آب معمولی شست وسپس آن را در محلول گندزدا در شرایط گندزدا باید به آهستگی بیرون ریخته شود ریز نمونه ها دست کم سه مرتبه مقطر سترون شده آبکشی شوند.

مراحل ریزازدیادی ریزازدیادی دارای چهار مرحله زیر است.

1.مرحله گندزدایی واستقرار در این مرحله یک قسمت مناسب گیاهی که ریز نمونه نامیده می شود گندزدایی شده ودرشرایط عاری از عوامل بیماری زا بر روی محیط کشت قرار داده می شود.با توجه به مشکلات ضدعفونی سطحی وترشح ترکیبات فنولی،مرحله استقرار ریز نمونه ها یکی از اساسی ترین بخش تکنیک کشت بافت این گیاه می باشد.استقرار ریز نمونه نهال پسته بعلت کم بودن ترشح ترکیبات فنولی با مشکل زیادی مواجه نمی شوداما ریز نمونه های گرفته شده از درخت بارده پسته در مرحله اول علاوه بر آلودگی،ترشح ترکیبات فنولی شدیدی را نشان میدهد واستقرار آنها بسیار مشکل است.به طور کلی بهترین نتیجه هنگامی قابل دستیابی است که ریز نمونه در حالت رشد فعال درخت پسته گرفته شود.هدف اولیه در مرحله استقرار،دستیابی به درصد زیادی از ریز نمونه هایی است که از عوامل بیماریزای سطحی عاری شده اند.

2.مرحله شاخه زایی هدف اصلی در مرحله شاخه زایی تکثیر سریع ریز نمونه ها است.برای شاخه زایی در مرحله ازدیاد،نوع هورمون،نوع محیط کشت ونوع ریز نمونه انتخابی کاملا تاثیر دارد.

انتخاب ریز نمونه در مرحله شاخه زایی جهت افزایش تعداد شاخه مناسب برای انتقال به مرحله ریشه زایی بسیار اهمیت دارد یکی از مشکلات اساسی مرحله شاخه زایی پسته،سیاه شدن وخشکیدگی انتهایی شاخه ها است.البته به دلایل این عارضه را به عوامل متعددی از جمله کمبود بر وکلسیم در محیط کشت ووجود یک بیماری فیزیولوژک ربط دهند ولی علت اصلی هنوز مشخص نشده است بهترین محیط کشت شاخه زایی در پسته کشت DKW یا MS به اضافه هورمون بنزیل ادنین BA می باشد.

مرحله ریشه زایی پس از مرحله شاخه زایی،شاخه های 1 تا2 سانتی متری گیاهچه ها پسته که دارای وضعیت خوبی باشند در محیط کشت ریشه زایی قرار می گیرند هدف از انتقال شاخه به محیط ریشه زایی تحریک به ایجاد ریشه نابجا از قاعده آن است.تا به یک گیاه کامل پسته تبدیل گردد.ریشه زایی با سن ریز نمونه رابطه مستقیم دارد.مرحله ریشه زایی 2تا 4 هفته طول می کشد.با ریشه دارشدن شاخه در این مرحله گیاهچه های پسته از حالت دگر غذایی به حالت خود غذایی در می ایند تا برای انتقال به شرایط آزاد امده گردند.بهترین محیط کشت ریشه زایی در پسته محیط کشت MS/2 یا DKW/2 به اضافه هورمون ایندول بوتیریک اسید IBA ونفتالین استیک اسید NAA می باشد.

4.مرحله سازگاری سازگار کردن عبارت است از فرایندی که توسط آن یک موجود با تغییر محیط سازگار شود گیاهچه های ریشه دار شده پسته در مرحله ریشه زایی جهت انتقال به زمین اصلی باید مرحله سازگاری را پشت سر بگذارند.این مرحله از سیستم ریز ازدیادی از اهمیت خاصی برخوردار است.گیاهچه های ریشه دار شده درون شیشه ای را باید داخل یک بستر مناسب کشت نموده و درشرایط رطوبت نسبی زیاد برای چندین روز نگه داشت.وجود حداقل یک ریشه در هر شاخه جهت سازگاری واستقرار گیاهچه های الزامی است.بعد از یک تا دو هفته،گیاهچه های پسته که با شرایط سازگار شده اند،قابل انتقال به خاک در گلخانه ویا در صورت مساعد بودن شرایط محیط قابل انتقال به زمین اصلی می باشند.

ترکیبات محیط کشت: معمولا هر محیط کشت دارای ترکیبات ضروری واختیاری زیر می باشد.

عناصر پر مصرف:عناصر پر نیاز شامل ازت،فسفر،پتاسیم،گوگرد،منزیم وکلسیم می باشند که هر محیط کشت با غلظت های مختلف استفاده می شوند.

عناصر کم مصرف:شامل آهن،منگنز،روی،بر،مس می باشد کبالت در بعضی موارد نیاز است.ولی می توان آن را از محیط کشت بافت،سلول ها قادرند غلظت بالای کلرو سدیم را تحمل کنند.

منبع کربن:گلوکز وساکارز جز بهترین منابع کربنی هستند در بعضی موارد فروکتوز نیز به کار می رود ولی به خوبی دو قند اول نمی باشند.سایر قندها لاکتوز،مالتوز،گالاکتوز ونشاسته به خوبی گلوکز وساکارز نمی باشد.

جهت تأمین مواد هیدروکربنی در محیط کشت ونیز تنظیم فشار اسمزی از هیدروکربن های استفاده می شود هیدروکربن ها (ساکارز،گلوکز،مانیتول وغیره)بسته به نوع آزمایش نوع ونسبت آن ها می تواند نقش مهمی داشته باشند ویتامین ها گیاهان در حالت عادی ویتامین مورد نیاز خود را سنتز می کنند.ولی وقتی سلول ها آن ها در محیط مصنوعی پرورش یابد از این نظر دچار محدودیت می شوند لذا بایستی بعضی از آن ها را به ترکیبات محیط کشت اضافه نمود ویتامین ها سبب کوچک شدن واکوئل ها وفعال شدن بیشتر سلول می شوند.

هورمون ها اکسین ها وسایتوکنین ها مهمترین هورمون ها هستند که در کشت بافت مورد استفاده قرار می گیرند از این مواد ایندول استیک اسید وزآنتین بطور طبیعی در گیاه تولید می شوند ولی بقیه که تنظیم کننده رشد نامیده شوند مصنوعی هستند.

مواد دیگر محیط کشت اسیدهای آمینه،گلوتامین،اسپاژین آدنین به عنوان مواد ازت آلی به کار می روند ولی ضروری نیستند در صورتیکه بخواهیم محیط کشت بصورت جامد باشد از آگار یا ژل به مقدار مورد نیاز استفاده می شود.

تهیه محیط کشت شاخه زایی برای تهیه ا لیتر محیط شاخه زایی مراحل زیر را طی می کنیم 1.حدود 14 استوک که هر کدام از قبل ساخته شده اند به ترتیب شماره به مقداریکه در هر لیتر لازم است را داخل 3/1 هزار لیتر اب می ریزیم 2.ساکارز را در حدود 30 گرم با ترازو وزن کرده وبه استوک و آب مقطر اضافه می کنیم هنگام اضافه کردن ساکارز یک مگنت داخل ارلن گذارده وآن را روی هیتر می گذاریم تا ساکارز کاملا حل شود.

3.ویتامین MS که حدود 4cc اضافه شود.

4.هورمون 1:1 BA 2mg در لیتر لازم است.

5.هورمون IBA 1:1 به اندازه 1cc در لیتر لازم است.

6.PH را با دستگاه PH متر اندازه می گیریم وبه 7/5 می رسانیم در صورتیکه PH محلولمان کمتر از 7/5 باشد با قطره چکان به آن Naoh اضافه می کنیم .اگر بیشتر از 7/5 باشد به ان HCL اضافه می کنیم بهد از هر اضافه کردن کاملا تکان می دهیم.

7.آگار به مقدار 7gr/lit برای سفت وژله مانند شدن محیط اضافه می شود هنگام اضافه کردن آگار ارلن را روی هیتر گذاشته وهمینطور که توسط مگنت محلول به هم می خورد کلید حرارت را هم روشن می کنیم تا گرم شود و برای اینکه PH تغیر نکند وآگار تبخیر نشود یک کاغذ آلومینیومی بر روی ارلن می گذاریم 8.استفاده از دستگاه dispenser به اندازه 30cc در هر شیشه از این محیط ریخته ودرب هر شیشه را با کاغذ های آلومینومی که قبل آماده شده می بندیم 9.شیشه ها را در دما وفشار معین و حدود 15 دقیقه در اتوکلاو می گذاریم تا استریل شود.

10.از اتوکلاو بیرون آورده می گذاریم تا سرد شود.

مواد لازم برای تهیه استوک DKWبر حسب mg/l 1.k2so4 1559 mg/lit 2.NH4NO3 1416 MG/LIT 3.CA(NO3)2.4H2O 1367 MG/LIT 4.MGSO4 361/49 MG/LIT 5.KH2PO4 265 MG/LIT 6.CACL2 112/5 MG/LIT 7.NA2_EDATA 45/4 MG/LIT 8.FESO4 33/8 MG/LIT 9.MNSO4 33/5 MG/LIT 10.ZN(SO3)2 17 MG/LIT 11.NA2MOO4 0/39 MG/LIT 12.CVSO4 0/25 MG/LIT 13.NISO4 0/005 MG/LIT 14.H3BO3 4/8 MG/LIT کارهای مقدماتی اتاق کشت با پوشیدن روپوش آزمایشگاهی وارد اتاق کشت می شویم در ابتدا هود را روشن می کنیم و20 دقیقه صبر می کنیم هوای استریل داخل ان رانده شود در طی این مدت وسایل لازم را از آزمایشکاه به داخل اتاق کشت منتقل می کنیم.

وسایل لازم عبارتند از:پتری دیش،پنس،بشر کوچک وبزرگ،ارلن حاوی آب مقطر استریل شده،پنبه الکل اتیلیک طبیعی،الکل صنعتی،ریز نمونه های امده شده،شیشه های حاوی محیط کشت از هر کدام از وسایل ذکر شده به تعداد مورد نیاز به داخل اتاق کشت منتقل می کنیم همچنین لازم به ذکر است مه پتری دیش،پنس ها وبشرها باید حتما استریل شده باشند واز داخل آون برداشته شوند بهد از سپری شدن این زمان دستکش پوشیده وماسک به دهان زده وارد اتاق کشت می شویم .در را می بندیم تا از ورود حشرات ومواد آلوده کننده به داخل اتاق جلوگیری شود سپس یک تکه پنبه روی میز هود گذاشته والکل اتیلیک روی ان می ریزیم وتوسط این پنبه الکلی دستهایمان را الکلی می کنیموشروع به ضدعفونی کردن هود می کنیم به این طریق که از گوشه آخر آن در قسمت بالا پنبه را از راست به چپ می کشیم به این ترتیپ با حالت رفت وبرگشتی ضد عفونی می کنیم سپس دیوارهای دو طرف ودر انتها کف آن را ضدعفونی می کنیم چراغ گاز وشیلنگ انرا تا جایی که زیر هود است استریل می کنیم.سپس وسایل مورد نیاز را با پنبه الکل استریل کرده وداخل هود منتقل می کنیم بشر وارلن که روی آن ها فویل قرار گرفته طوری باید استریل شوند که مخصوصا کاغذ آلومینیومی کاملا به الکل آغشته می شود.در استریل کردن شیشه های حاوی محیط کشت هم باید دقت داشت که مخصوصا درب آن ها بسته باشد وخوب استریل شود.

کشت بذرها در محیط کشت ابتدا فویل روی یکی از بشرهای کوچک را باز کرده بذرهای آماده شده داخل آن ریخته وایتکس با غلظت مورد نظر را داخل آن ریخته ودرانتهای هود می گذاریم بشر بزرگی را برداشته فویل روی آن رابرداشته و درلبه سمت راست هود قرار می دهیم یک بشری برداشته درب آن را طوری باز می کنیم که دست با لبه آن تماس پیدا نکند ودر انتهای هود قرار می دهیم فویل پنس را برداشته وبا حرارت ان راضد عفونی می کنیم و روی پتری قرار می دهیم.بذرها باید 20 دقیقه درون وایتکس باشند در طی این مدت چند بار قسمت پایین بشر را می گیریم وتکان می دهیم بعد از سپری شدن این مدت یک بشر کوچک دیگر بر میداریم فویل ان را برداشته لبه هایش را حرارت میدهیم وبا پنس بذرها را برداشته ودر داخل شیشه های که از قبل استریل کرده بودیم قرار میدهیم (ودر داخل هر شیشه 4 تا5 بذر قرار میدهیم) واین کار را برای تمام شیشه ها انجام میدهم وپس از پایان کار شیشه ها را داخل انیکوباتور قرار میدهیم.

بعد از گذشت چند روز نمونه ها به محیط کشت حاوی هورمون (شاخه زایی،ریشه زایی)منتقل می شوند.