دانلود مقاله گزینش و جداسازی سلول

پیشگفتار این فصل دو مقوله: گزینش (Selection) و جداسازی(Isolation) سلول را در بر میگیرد.

تقسیم بندی فوق از نظر اولویت صورت گرفته است.

برای کسب بهینه ترین نتیجه، بهتر است که ایزولاسیون و گزینش به طور همزمان صورت گیرد.

بغیر از سلول‏های سیستم خون سازی و بافت‏های جنینی خاص سلول‏های معمولی دیگر ذاتاً به ماتریس‏های خارج سلولی مرتبط می شوند.

شیوه‏های متفاوت پاره کردن (گسیختن) ماتریس‏ها نه تنها بر کارائی گوراش آنزیمی بلکه بر جمعیت سلولی تأثیر می گذارد.

همچنین سیستم کشت سلولی که شامل ماده بازال (بنیادی) و مکمل‏ها است نه تنها با فراهم کردن مواد غذایی و شرایط مناسب بر بقای سول‏ها تأثیر می گذارد بلکه می تواند یک پتانسیل گزینشی قابل ملاحظه را در ترجیح یک نوع سلول بر دیگری اعمال کند.

نوشته‏های فراوانی درمورد موضوعات این فصل وجود دارد.

ایزولاسیون و پاک سازی سلول‏ها یک فرایند پیچیده است و یکی از اهداف این فصل کمک به آسان نمودن این پیچیدگی است.

برای کسب اطلاعات مفصل در مورد جنبه‏های گوناگون کشت سلولی لطفاً به نوشته‏های فرشنی اشتودزینسکی و مسترز مراجعه کنید.

- ایزولاسیون سلول CELL ISOLATION تحقیقات به خوبی نشان می دهد که انواع سلول‏های مشابه مانند سلول‏های فیبروبلاست، اندوتلیال یا پری ادیپوسایت‏ها در محل‏های آناتومی مختلف دارای مشخصه‏های متفاوت هستند.

اما این موضوع که چگونه سلولهای آناتومی یک محل نیز مشخصه‏های متفاوت از خود نشان می دهند هنوز به خوبی شناخته شده نیست.

ناهمگنی سلولی (هیتروژنیتی) در اثر خصوصیات ویژه آنها رخ می دهد.

این خصوصیات می تواند یکی از پارامترهای عملیاتی جمعیت سلولی باشد.

پدیده فوق با این تصور که خصیصه‏ها لزوماً در داخل جمعیت سلولی دارای توزیع همگن (هموژن) نیستند قابل توجیه است.

فیبروبلاست‏ها جمعیتی هستند که در داخل محل آناتومی از خود خصوصیات فنوتیپیکی متفاوت نشان می دهند، مطالعات فرایز و همکارانش همچنین لکیک و همکارانش را بر روی موش، ریه انسان، لثه (پیرادندانی) و هتروژنیتی (ناهمگن) فیبروبلاست لثوی ملاحظه کنید.

همچنین مشاهده شده است که فیبروبلاست‏ها عکس العمل‏های متفاوتی به تحریکات کلاژن‏های آزاد شده توسط تومور یا سلول‏های قلیا خواه (mast cells) نشان می دهند.

علاوه بر این فنوتیپ‏های مختلف سلول‏های اندوتلیال عروق کوچک در کورپوس لوتئوم (جسم زرد گاو) (luteum bovine corpus) با در نظر گرفتن اکتین، سایتوکراتین و ویمنتین حساس به گاما، اینترفرون (IFN-) نشان دهنده هتروژینتی است.

منطقی است اگر کل جمعیت سلولها را با توجه به خصیصه‏هایشان در هتروژنیتی (ناهمگن) دخیل بدانیم.

هدف سنتی از انجام کشت سلول‏های اولیه تهیه مقدار کافی از سلول‏های قابل رشد واجد شرایط می باشد که تضمین کننده شباهت توزیع نهایی سلول‏ها با توزیع یافته شده در بافت اصلی است.

استفاده از کشت سلولی به عنوان مدلی برای شرایط داخلی بدنی (in vivo) تا حد.ود زیادی به الزامات زیر نیازمند است.

چندین فاکتور مؤثر بر نتیجه عبارتند از: محل آناتومی، پاتولوژی (آسیب شناسی)، نرمالسی (normalsy) یا درجه ایسکمی (کم خونی) میزان فراوانی بافت به کار رفته بر این فاکتور‏ها تأثیر می گذارد.

طبیعت متنوع معماری بافت به روش‏های مختلفی برای توزیع سلول نیازمند است.

برای مثال استخوان، مغز، ماهیچه‏های اسکلتی کبد و طحال دارای پیوندهای ماتریس سلول- سلول و سلول- برون سلولی هستند.

نتیجه این شرایط این است که هیچ قراردادی همه انواع بافت را پوشش نمی دهد.

در مورد نحوه ایجاد کشت اولیه و تجزیه بافت مطالب چندی منتشر شده است که تلاش در بهینه سازی این موضوعات برای سلول نتیجه بخش خواهد بود.

-توضیح استراتژی‏های مختلفی برای ایزولاسیون سلول‏های موجود در بافت‏های سخت وجود دارد از جمله: روشهای برون کاشت (explantation) آنزیمی، مکانیکی و تجزیه شیمیایی، (chemical disaggregation) تزریقی (perfusion) یا ترکیبی از آنها.

یکی از جدید ترین شیوه‏ها در جداسازی سلول و تکثیر سلول‏ها در داخل آزمایشگاه (in vitro) برون کاشت قطعه‏های بافت است.

در این روش تا زمانی که انتشار مواد غذایی و گازها محدود نشود بافت به قطعات بسیار کوچک خرد میشود.

این عمل با بریدن و کوچک سازی بافت مورد نظر تا اندازه ای مناسب صورت می گیرد.

سپس قطعات باف در ظروف کشت بافت که با سرم جنینی گاو (fetal bovine serum) یا ماتریس‏های دیگر پوشیده شده است قرار داده می شود.

ترکیب ماده و پوشش سطح همان طور که در ایزولاسیون انواع سلول از گلومرول‏ها (glomerulus) نشان داده شده است، می تواند اثر قابل توجهی بر نوع سلول نهایی تولید شده داشته باشد.

همچنین می توان قطعات بافت را برای تثبیت اتصال در زیر پوشش قرار داد زیرا تماس مستقیم با سطح کشت بافت برای کشت موفق برون کاشتنی (explant) ضروری است.

عموماً برای قرار دادن بافت در محیط کشت از دستگاههای مکانیکی استفاده شده و هیچ گونه آنزیمی اضافه نمی گردد.

کشت اولیه توسط روش برون کاشت نسبت به دیگر روشها زمان بیشتری را طلب می‌کند، اما روش برون کاشت به خاطر استفاده از خاصیت حساسیت پتانسیلی سلول مورد نظر به ترکیب آنزیم دارای مزایای بیشتری است.

اگر آنزیم قابل ارائه در محیط باشد می توان بافت را با غلظت آنزیمی بهینه برای مدت کوتاهی در دمای اتاق و یا برای مدت طولانی تری در دمای c0 4 نگهداری کرد.

در اینجا هدف، تجزیه بافت نیست بلکه سازگار کردن مناسب ماتریس برون سلولی جهت حرکت مؤثر سلول مورد نظر است.

دلیل انتخاب روش برون کاشت، حفظ سطح غشاء عملیاتی است.

همچنین در مواردی که نمونه بافت موجود کوچک باشد روش جداسازی آنزیمی با مکانیکی بسیار مخرب بوده و سلول‏های فراوانی از دست می روند که ادامه کار را غیر ممکن می سازد.

تأثیر آنزیم‏های پروتئولیتیک بر اجزا سطح سلول شناخته شده است، به طور مثال، ایموگلوبولین سطح (Ig) در اثر پروناز و کیموتریپسین به سرعت از لنفوسیت‏های B جدا شده ولی در اثر تریپسین و پاپائین این عمل کندتر انجام می شود و توسط کولاژن‏ها اصلاً صورت نمی گیرد.

همچنین تریپسین در مقایسه با کلاژن فسفولیپیدها و اسیدهای چرب رادیواکتیو بیشتری را از غشاء اندوتلیال سلول آزاد می‌کند.

کشت اولیه برون کاشتی به قابلیت حرکت نوع سلول مورد نظر بستگی دارد از معایب این روش بالاتر بودن پتانسیل رشد انواع سلول آلاینده نسبت به سلول مورد نظر و مشکل پیوستگی قطعات بافت است.

از طرف دیگر اگر سلول مورد نظر پر تحرک ترین سلول باشد این روش می تواند تکنیک منتخب باشد.

یکی دیگر از موارد مورد توجه از بین رفتن مشخصه‏های فنوتیپیک سلول‏های به واسطه گوارش آنزیمی است.

اگر سلول‏ها دقیقاً بعد از جداسازی مورد استفاده قرار گیرند، گوارش آنزیمی ضروری است.

البته اگر هدف ایجاد یک جمعیت کشت سلولی آزمایشگاهی باشد شرایط اولیه سطح سلول از اهمیت کمتری برخوردار خواهد بود.

ساختارهای غشائی با پارامتر تحمل وارونگی توصیف شده و برای یک جمعیت سالم سلولی می توان فرض کرد که ساختارهای سطح قابل ترمیم خواهند بود.

البته این وضعیت برای هر نوع سلولی معتبر است.

- مکانیکی MECHANICAL روش‏های مکانیکی قطعه قطعه کردن بافت شامل روش گردابی، تکان دادن در شیکر چرخشی، پودر سازی با پیپت‏هایی با قطرهای متفاوت، عبور بافت از میان شبکه‏های نایلون و یا فولاد ضد زنگ و خرد کردن بافت با سوزن‏های نازک می شود.

این فرایندها تعلیق سلول را زودتر از گوارش آنزیمی ایجاد می کنند، البته محدودیتهایی در این مورد وجود دارد.

این روش‏ها به طور کلی برای همه بافتها مؤثر نیستند.

تشخیص نوع روش بستگی به مقدار نیروی اعمال شده به بافت داشته که این جنبه می تواند سبب آسیب شود.

سلول‏ها به برش حساس بوده و آسیب جدی می بینند.

برش سلولهای استوبلاست شکل MC3T3-E1 به دست آمده از جمجمه نوزاد موش سبب تغییر مورفولوژی ‍(شکل) و کاهش تدریجی کلسیم بین سلولی باقی مانده گردید.

همچنین رشد سلول‏های اندوتلیال به واسطه تنش برشی تیغه ای متوقف شد.

ادامه این بحث در صفحات بعد آمده است.

البته در مورد برخی از بافت‏های نرم از جمله طحال، تیموس، گره‏های لنفی کبد جنینی و تومورهای نرم و احتمالاً مغز می توان تجزیه مکانیکی را بدون آسیب سلولی اجرا کرد.

روش‏های مکانیکی در پاسخ به اثرات بالقوه زیان آور آنزیم‏ها درطول گوارش توسعه پیدا کردند.

هنگامی که شرایط ایزولاسیون مناسب برای وسایل مکانیکی مهیا باشد این روش بر روش گوارش آنزیمی بخصوص بازسازی سلولی ارجعیت دارد.

تحت این شرایط کاهش معرف‏هایی مانند آنزیم‏ها وجود منابع، تأثیرات و هر گونه مطلب قانون مند دیگر را غیر ضروری می سازد.

البته زمانی که روش‏های مکانیکی با گوارش آنزیم همراه شود مؤثر تر خواهد بود.

لایه لایه کردن بافت با چاقوی جراحی برای کم کردن اندازه بافت و در نتیجه افزایش سطح منجر به ایزولاسیون مؤثر تر می گردد.

-گوارش آنزیم ENZYME DIGESTION نوع آنزیم به کار رفته بر نتیجه گوارش تحت عناوین بازده، راندمان محصول، قابلیت رشد و سمیت تأثیر می گذارد.

ایزولاسیون سلول‏ها از تومورهای سخت با استفاده از تجزیه آنزیمی یا مکانیکی منجر به فراوانی‏های متفاوت می شود.

در بافت ایزوله شده به روش آنزیمی، زیر جمعیت آنوپولید (aneuploid subpopulation) در مقایسه با بافت به دست آمده از تجزیه مکانیکی نمایان تر است.

که بیانگر آسیب پذیری متفاوت جمعیت‏های مختلف سلول‏های بافت در برابر ترکیبات آنزیمی است.

همچنین درمطالعات انجام شده بر فرایند جداسازی هپاتوسایت موش در هنگام استفاده از EDTA به جای کولاژن محتویات سایتوکروم 450 P قابل شناسائی به روش طیفی و مدت دار و حفظ و نگهداری سیستم اکسید از با کار کرد ترکیبی به دست آمد.

در مورد این مشاهدات استثناهائی نیز وجود دارد: مطالعات نشان می دهد که سلول ‏های توموری را می توان با استفاده از گوارش آنزیم بسیار مؤثر تر از روش‏های مکانیکی جدا کرد .

و اینکه کلاژن‏های ایزوله شده پیگ هپاتو سایت‏ها خیلی بیشتر از EDTA ایزوله شده هپاتوسایت‏ها زنده می مانند.

یک تفسیر در مورد این نتایج متنوع بر مبنای حساسیت نسبی سلول‏ها نسبت به آنزیم‏ها و تجزیه مکانیکی استوار است.

تأثیر بسیاری از متغیرهای غیر قابل کنترل نیز (به طور مثال شرایط بافت) بر این مشاهدات اضافه می شود.

نوع آنزیم به کار رفته بر نتیجه گوارش تحت عناوین بازده، راندمان محصول، قابلیت رشد و سمیت تأثیر می گذارد.

در مورد این مشاهدات استثناهائی نیز وجود دارد: مطالعات نشان می دهد که سلول‏های توموری را می توان با استفاده از گوارش آنزیم بسیار مؤثر تر از روش‏های مکانیکی جدا کرد .

هپاتو سایت‏های ایزوله شده موش بالغ به وسیله تزریق تریپسین و کلاژن نشانگر خصوصیات متفاوت بود: هپاتو سایت‏های کلاژنی دارای بازده چسبندگی دو برابر بوده و مدت طولانی تری در محیط کشت باقی می ماندند، همچنین تولید آلبومین بیشتری داشته و فعالیت تیروسین آمینو ترانسفراز در آنها در مقایسه با هپاتو سایت‌های جدا شده توسط تریپسین بیشتر است.

در جداسازی پروسین از جزایر لوزالمعده توسط گوارش با کلاژن، جزایر بزرگ به فعالیتهای پائین تریپتیک و نتایج جداسازی ضعیف به فعالیت بالای تریپتیک مرتبط می شود.

باز داشتن تریپسین توسط پفابلوک (Pefabloc) منجر به بهبود تکثیر جداسازی در جزایر لوزالمعده می شود.

نکته جالب در مورد ایزولاسیون توسط گوراش با آنزیم خارجی نقشی است که ترشح داخلی آنزیم‏های پروتئولیتیک به واسطه فرایند گوارش ایفا می کند که این ترشح خاص بافت است.

بافت‏های به دست آمده از اهدا کنندگان مختلف نسبت به گوارش آنزیم عکس العمل‏های متفاوتی نشان می دهد.

از ‎آن جا که لوزالمعده محل سنتز تریپسین است باید به جداسازی سلول‏های جزایر لوزالعمده توجه داشت تا امکان ایجاد فراگوارش وجود نداشته باشد.

امروزه می دانیم که تریپسین می تواند به غشاء سطح آسیب وارد کند، اما ظاهراً نقش ذاتی تریپسین نیز در این مورد دخالت دارد.

مطالعه دمایی تریپسین در طول یک مسیر متوالی نشان داد که دماهای زیر c0 15 زیست پذیری (viability) و تکثیر را افزایش می دهد این وضعیت با تأثیر دما بر پدیده‏های ذاتی دیگر غشاء سازگاری می دارد.

اگر مشکل اصلی زیست پذیری باشد، استفاده از دمای پائین تر در طول گوارش پیشنهاد می شود.

برای گوارش بافت، اغلب کلاژنهای تجاری به دست آمده از کلستریدیوم هیستولیتیکم مورد استفاده قرار می گیرند.

تغییرات درجه ناخالصی بازدهی و سمیت توصیف کننده ترکیبات خام هستند ترکیبات خام تعریف نشده هستند و از کلاژنازهای مختلف، پروتئاز‏ها، فسفولیپازها و باکتریهای همراه با محصول مانند اندوتاکسین تشکیل می شوند.

با توجه به نبود یک تعریف مشخص برای ترکیبات کلاژن‏ها، وجود تفاوت‏های قابل ملاحظه بین محصولات فروشندگان مختلف و حتی یک فروشنده ثابت دور از ذهن نیست.

تلاش برای تصفیه ترکیبات کلاژناز خام توسط بازده گوارش بافت احیا شده توصیف شده و نشان دهنده حضور پروتئاز‏های تصفیه شده که یک استراتژی مؤثر است، جهت تأئید عدم وجود اثرات زیانبخش باید دقت لازم به عمل آید.

استفاده از سیستم‏های آنزیمی مشخص با افزایش تعداد محصولات درمان سلولی اهمیت بیشتری پیدا می‌کند.

سازمان‏های قانونمند برای نیل به اهداف خود نیازمند شرح کامل اجزاء معرف‏های به کار رفته در ترکیبات محصولات هستند.

وجود اجزاء نامشخص مانند ترکیبات آنزیم سبب ایجاد رقابت شدید میگردد.

-تروما TRAUMA بافت‏های بیرون آورده شده دچار ایسکمی می شوند.

مدل‏های ایسکمی بازتزریقی (Ischemia-reperfusion models) توسط واکنش‏های انفجار گونه اکسیژن (ROS) توصیف می شوند.

البته در اثر تولید سوپر اکسید و پراکسیداسیون لیپید در نبود باز تزریق نیز امکان صدمه دیدن وجود دارد یک اظهار نظر ظاهراً درست بیان می‌کند که در طول ایسکمی میزان کافی برای حفظ محصول سوپر اکسید وجود دارد.

این گفته به نظر صحیح می رسد زیرا به کار گیری دیسموتاز سوپر اکسید (SOD) سیگنال ROS را تضعیف می‌کند.

اگر SOD به عنوان ضد اکسید کننده اضافه شود باید کاتالاز نیز اضافه گردد زیرا محصول دیسموتاسیون سوپراکسید پراکسید هیدورژن است که به تنهایی قابلیت آسیب رسانی دارد.

همچنین رادیکالهای آزاد تحت شرایط هیپوکسی در سلول‏های ماهیچه ای نرم شریان ریوی موش نشان داده شدند.

به کار گیری ضد اکسیده کننده‏هایی مانند ویتامین E ، ان- استیل- ال- سایستاین یا دی فنیلین یدوئیم نشان دهنده کاهش سطوح ROS و مرگ سلوهای بعدی است.

همچنین بازدارنده‏های پروتئاز مانند ماکروگلوبولین و ضد اکسید کننده‏های ان- استیلن- ال سایستاین تعداد سلول‏های آزمایشگاهی ژرم (germ cells) نخستین خوک را افزایش می دهد.

طولانی شدن و قرار گیری در معرض ROS منجر به مرگ بافت یا اپوپتوزیس می گردد.

قرار گرفتن در معرض شدت بالا به مدت طولانی می تواند به مکانیزم اپوپتوتیک آسیب وارد کرده و مستقیماً منجر به مرگ بافت شود.

فاکتورهای رشد مانند فاکتور سلول استم(ساقه) و فاکتور باز دارنده سرطان خون (لوسمی) می تواند جلوی اپوپتوزیس را گرفته و سبب بقای سلول ژرم نخستین جنین موش شود.

هنگامی که سلول‏های چسبنده از هم باز می شوند حالت اپوپتوزیس یا به اصطلاح آنویکیس را می گیرند.

ROS نیز با تأثیر گالکتین-3 بر آپوپتوزیس در این شکل گیری سهیم است .

افزودن اسید بانگکرکیک که یک بازدارنده انتقال نفوذپذیری میتوکندری است به طور قابل ملاحظه ای آنویکسیس استئوکلاست‏ها را همانند حضور z -VAD-FMK که یک بازدارنده کاسپیس است کاهش می دهد در ایزولاسیون سلول جزایر پانکراس ترکیبات (محتویات) مرتبط با ماتریس خارج سلولی برای مدت طولانی تری در محیط کشت زنده باقی مانده و در آزمون ترشح انسولین بهتر عمل می کنند همچنین سلول‏های جنینی پانکراس با ملاحظه و رعایت موارد آپوپتوتیک و تغذیه ای از مرگ ایمن بوده وان- استیل- ال- سایستاین از اپتوزیس در سلول‏های جرم انسانی در محیط آزمایشگاه جلوگیری می کنند.

ایزوله کردن برخی از انواع سلول‏ها مشکل است.

فاکتورهای زیادی در موفق بودن ایزولاسیون سلول و استقرار بعدی سیستم کاشت سلول دخیل هستند.

ملاحظه ترومای سلول در بهتر شدن نتیجه نهایی تفکیک سلولی کمک می‌کند.

-سنجش زیست پذیری (بقاسنجی) MEASUREMENT OF VIABILITY تغییر پذیری ذاتی عکس العمل‏های بافت به وضعیت‏های گوناگون کشت سلولی نیاز به وسیله ای برای ارزیابی زیست پذیری سلول‏های حاصل از این شرایط را دارد.

سنجش زیست پذیری در بهینه سازی روش‏های کشت اولیه نسبتاً راحت است.

بهترین راه برای ارزیابی زیست پذیری سلول استفاده از روش‏هایی است که اثر تروما را مورد ملاحظه قرار می دهد.

به طور کلی کاهش استحکام (یکپارچگی) غشاء سلول در آخرین مراحل تروما اتفاق می افتد که این امر منجر به تخمین بیش از اندازه زیست پذیری سلو می گردد.

برای مثال شروع و پیشرفت اپوپتوسیس (opoptosis) بدون ایجاد اختلال در غشاء سلول رخ می دهد.

با وجود ترکیب دوباره فسفولیپید‏ها معمولاً فسفا تیدیل سرین با ورقه داخلی غشاء دولایه پلاسما مرتبط شده و در طول اپوپتوسیس به قسمت بیرونی منتقل می شود.

آرایش نهایی سلول که آشکار شدن آن ممکن است مدت‏ها طول بکشد تا حد زیادی به وقایع زیان آوری که عامل آغاز آپوپتوسیس است بستگی دارد.

از طرف دیگر آسیب ممکن است چنان شدید باشد که یکپارچگی سلول در چندین دقیقه لطمه ببیند، بنابراین ارزیابی یکپارچگی سلول می تواند مفید باشد.

آزمون‏های زیست پذیری مختلفی برای اندازه گیری یکپارچگی غشاء وجود دارد.

یکی از متداولترین روش‏ها، ممانعت آبی تریپان نام دارد که بر مبنای ویژگی ممانعت سلول‏های زنده و رنگی شدن آنها و نفوذپذیری سلول‏های غیر زنده و رنگی شدن آنها استوار است.

این آزمون شامل نگهداری سوسپانسیون سلول برای مدت کوتاهی (min 5 یک نمونه از سنجش مستقیم جذب رنگ توسط سلول‏های زنده در ذیل آمده است.

سلول‏های زنده رنگ غیر فلورسنت دی استیل فلورسئین را میگیرند، سپس درون سلول استیل مویتیز آزاد شده و فلورسئین تولید می گردد که فلورسنت بوده و غشاء سلول نسبت به آن ناتراوا است.

در طول موج‏های گسیلی با تحریک مناسب سلول‏های زنده، رنگ فلورسان سبز از خود ساطع می‌کنند.

این خصوصیت را می توان هم با محاسبه بصری توسط میکروسکوپ فلورسان و هم توسط تفکیک سلولی اندازه گیری کرد.

سرم می تواند دی استیل فلورسئین را هیدرولیز کند، بنابراین آزمون‏های به اصطلاح طولانی مدت در صورتی که سرم جزئی از ماده باشد توصیه نمی شود.

همچنین فلورسانس فلورسئین بستگی به PH داشته و نیازمند بافرهای (تثبیت کننده‏های) غیر بیوکربناتی است.

این عامل عمدتاً در آزمون بقا سنجی از دخول محیط کشت سلولی جلوگیری می کنند مگر اینکه توسط بافرهای موثر غیر بیوکربناتی مانند HEPES یا بافرهای آلی دیگر محافظت شوند.

حساسیت بهتر با ترکیب یدپروپیدیم و دی استیل فلورسئین به دست می آید.

یدیروپیدیم نسبت به سلول‏های زنده ناتراوا و نسبت به سلولهای غیر زنده تراوا است.

تحت این شرایط سلول‏های زنده از خود نور سبز فلورسانت و سلول‏های غیر زنده نور قرمز روشن (درخشان) ساطع می کنند.

در مقایسه با روش تریپسین آبی مشخص می شود که پایداری روش دی استیل فلورسئین- یدپروپیدیم در حضور رنگ‏ها در مدت زمان طولانی بیشتر است.

وضعیت انرژی سلول با توجه به غلظت نوکلئوتید آدینیلیت یکی از نشانه‏های مهم زیست پذیری به شمار می رود.

این رابطه به دلیل دخالت میتوکندری در آغاز اپوپتوزیس منطقی است.

یکی از پارامترهای سطح انرژی سلول بار انرژی است این شاخص توسط نسبت ذیل معین می‌شود: [ATP]+0.5[ADP]/[ATP]+ADP]+[AMP] مقدار این نسبت برای سلول‏های طبیعی در حدود 9/0 بوده و شروع کاهش از این مقدار نشانگر آغاز اتلاف زیست پذیری است.

برای مثال اندوتلیال کشت شده و سلول‏های P388D1 پس از تحمل تنش اکسید کننده ‍(اکسیدانت) افت بار انرژی از 95/0 تا 66/0 را در دقیقه اول نشان می دهند، در صورتی که در روش تریپان آبی تا قبل از 30 دقیقه نخست پس از شروع تنش هیچ گونه تغییری مشاهده نمی شود.

-گزینش SELECTION گزینش بر اساس خاصیت‏های منحصر به فردی که یک سلول را از دیگری متمایز می‌کند مانند چگالی اندازه، نشانه‏های اختصاصی (مارکر) گذر راههای منحصر به فرد متابولیکی و احتیاجات غذایی صورت می پذیرد.

-چگالی و اندازه DENSITY AND SIZE در سانتریفوژ نرخ ته نشینی ذرات به نیروهای اعمال شده چگالی و وسکوزیته مایع بستگی دارد.

بنابراین با یک نیرو و ویسکوزیته معین نرخ ته نشینی متناسب با اندازه ذره و اختلاف بین چگالی ذره و چگالی مایع خواهد بود.

در نتیجه نرخ ته نشینی در زمان صفر شدن اختلاف بین چگالی ذره و چگالی مایع به صفر نزدیک می شود.

همچنین نرخ ته نشینی با افزایش نیروی سانتریفوژ افزایش یافته و در اثر بالا رفتن ویسکوزیته مایع کاهش می یابد.

از آنجا که چگالی و ویسکوزیته مایع اثر قابل ملاحظه ای بر نرخ ته نشین ذرات دارد مواد و محلول ‏های گرادیانی گوناگونی بر اساس این خواص توسعه پیدا کرده اند.

مواد کنتراست ترکیب شده با «ید» که در ابتدا برای مطالعات بالینی کنتراست اشعه x توسعه یافتند در ایزولاسیون سلولی نیز مفید واقع شدند.

سری‏های مختلفی از این مواد کنتراست بر اساس ساختار یونی غیر یونی، منومری یا دیمری وجود دارند.

دامنه این مواد از متریزوات تا متریزامید گسترش یافته است.

(که اولی از گونه غیر یونی است) و نیکودنز که یک ماده با سمیت کمتر بوده و و برای ایزولاسیون نوتروفیل‏ها، پلاکت‏ها، سلول‏های استلیت (ستاره شکل) پری آسینار لوزالعمده یا سلول‏های کوپفر استفاده می شود.

فیکول که یک پلی سوکرز مصنوعی است به طور گسترده در ایزولاسیون گونه‏های سلولی مگا کاریو سیتها هپاتوسیت‏ها، سلول‏های جزایر لوزالعمده، نوتروفیل‏ها و لنفوسیت‏ها به کار برده می شود.

ترکیب دیاتریزوات سدیم (ماده کنتراست یونی-هیپاک) با فیکول یا ترکیب متریزوات سدیم با فیکول (لیمفوپرپ) عمدتاً در گزینش سلول‏های خونی به کار گرفته می شود.

یک ماده گزینشی نسبتاً جدید، پرکول است که از کلوئید سیلیس پلی دیسپرس با پوشش پولی ونیل پیرلیدن (PVP) تشکیل شده و کاربرد فراوانی پیدا کرده است.

پوشش PVP سبب خنثی کردن نسبی سیلیس از نظر پایداری PH و استقامت یونی فیزیولوژیکی می شود.

برای دیدن مباحث مربوط به انواع سلول‏هایی که توسط پکرول از خون و ارگانهای مختلف دیگر جدا شده اند به منابع مراجعه کنید.

این مواد گزینش گر به عنوان نخستین گام در کاهش سلول سازی ترکیبات سلولی به نحوی که دیگر روش‏های خاص جدا سازی را نیز بتوان به خدمت گرفت استفاده میشوند.

این مواد گرادیانی اجازه تشکیل محلول‏هایی با چگالی مناسب برای باند کردن سلول‏ها طبق چگالی شناوری (buoyant) بدون اینکه سلول‏ها تحت هیچ گونه تنش اسمزی یا یونی قرار داشته باشند را می دهد.

ماده گرادیانی قادر است که بر اساس چگالی یا اندازه سلول‏ها را تفکیک کند.

برای گزینش بر مبنای چگالی ماده گرادیانی به نحوی ساخته می‏شود که حیطه چگالی آن کل محدوده چگالی سلول‏های موجود در ترکیب را در بر میگرد.

این فرایند جهت اطمینان از این مسئله است که تحت نیروی سانتریفوژ اعمال شده، سلول‏ها به سطح تعادلی تحت عنوان سطح ایزوپیکنیک رسیده اند که در این سطح چگالی محیط میشوند.

تحت این شرایط اندازه نقش مهمی را ایفا نمی‌کند.

چگالی یک سلول می تواند توسط خاصیت اسمزی محلول تحت تأثیر قرار بگیرد.

در یک محیط‏هایپرتونیک (پرفشار) سلول کوچک شده و چگالی شناوری به واسطه حذف آب افزایش می یابد زیرا ماده‏هایپرتونیک سلول‏ها را متورم کرده و چگالی شناوری آنها را کاهش می دهد.

میزان اسمزی یک ماده بخصوص در هنگام جداسازی ایزوپیکنیک باید کنترل شود.

مشخصه این مواد نشانگر توانایی آنها در رسیدن به کنترل غیر وابسته به چگالی و خاصیت اسمزی است.

جداسازی سلول‏ها بر اساس اندازه یا سرعت نیازمند این است که ماده گرادیانی کم چگال تر از سلول‏های موجود در ترکیبی باشد که باید جداسازی شود.

تحت این شرایط گرادیانی سلول‏ها وضعیت ایزوپیکنیک نداشته و جداسازی بر اساس اندازه مشخص می شود به این صورت که سلول‏های بزرگ سریعتر از سلول‏های کوچک جابجا می شوند.

این وضعیت قبل از رسیدن سلول‏ها به کف لوله متوقف می شود.

جداسازی ایزوپیکنیک به سرعت سانتریفوژ بالاتری نسبت به جداسازی سرعتی نیاز دارد.

اگر سلول مورد نظر به سرعت‏های بالا حساس باشد در جداسازی ایزوپیکنیک باید توجه کافی مبذول شود.

برای دستیابی به موادی با چگالی‏های مختلف از روشهای پیوسته یا ناپیوسته استفاده می شود.

گرادیان‏های ناپیوسته، تغییرات ناگهانی و یا واسطه‏هایی را در طول لوله سانتریفوژ ایجاد می کنند.

تغییر یک چگالی خاص در هنگامی که ماده جداساز به عنوان بالشتک عمل می‌کند می تواند عمل جداسازی سلول را انجام دهد مانند وضعیت لویکوسیت‏های تک هسته ای در زمان استفاده از گرادیان پکرول.

همچنین می توان از یک سری تغییرات ناگهانی چگالی برای جداسازی اعصاب دوپا مینرژیک شکمی و سینه ای جنین موش و جداسازی اسپرم بارور X از اسپرم بارور Y استفاده کرد.

گرادیان‏های چگالی ناپیوسته بدلیل جمع شدن سلول‏ها در حد فاصل‏ها می توانند سبب ایجاد عوامل خارجی ناخواسته (آرتیغکت) شده و شناخت سلول‏های با چگالی متفاوت وابسته به ناهمسانی چگالی در گرادیان‏های ناپیوسته را مشکل می سازند.

گرادیان‏های پیوسته به وسیله گرادیان سازها یا به صورت پکرول توسط گرادیان‏های خود ساز شکل میگرند.

پکرول در اثر نیروی سانتریفوژ بیشتر از g10000 شروع به ته نشینی می‌کند.

و از آنجائی که پکرول یک کلوئید چند طیفی (پلی دیسپرس) است ذرات با نرخ‏های متفاوت ته نشین می شوند که سبب ایجاد گرادیان نرم میشود.

تحت این شرایط ممکن است سوسپانسیون سلول با پکلرول آمیخته شده و عمل سانتریفوژ در سرعت‏های بالا منجر به تولید گرادیانی شود که پس از آن، سلول‏ها بر اساس گرادیان شکل گرفته جدا می شوند.

در این مورد دو نگرانی وجود دارد.

اول اینکه نرخ بالای سانتریفوژ ممکن است به سلول‏ها آسیب برساند و دوم اینکه احتمال جذب پکرول توسط لیزوزوم‏ها وجود دارد البته پکرول جهت جداسازی انواع لیزوزومال‏های با چگالی‏های مختلفی در هپاتوسیتهای موش بدون تأثیر در چگالی لیزوزوم‏ها به کار برده می شود.

-نشانه‏های اختصاصی (مارکر)سلول UNIQUE CELL MARKERS ساختمان سلول‏ها در بافت‏ها با توجه به عملکردشان در درون سلول ناهمگن است.

این ساختارها نه تنها نشانگر عملکرد منحصر به فرد سلول‏هاست بلکه وسیله ای برای تشخیص آنها می باشد بخصوص اگر این ساختار در سطح سلول باشد.

گزینش استثنائی پادتن‏های منوکلونال (تک تاگی) سبب ایجاد روش‏ها و تجهیزات مختلفی شده است که به منظور بهره برداری از این اختلافات به کار برده می شوند.

-دسته بندی سلول فلورسنت فعال شده (FACS) Fluorescent- Activated Cell Sorting (FACS) دسته بندی سلول فلورسنت فعال شده به روش سلول سنجی (سایتومتری) روان انجام می شود که یکی از پیشرفته ترین تجهیزات در جهت بهره برداری از تکنولوژی پادتن‏های منوکلونال می باشد.

عملکرد این دستگاه بر اساس قابلیت ایجاد جریانی از سلول‏های منفرد است که به طور انتخابی توسط صفحات منحرف کننده با بارهای مخالف قابل تغییر جهت هستند.

در ابتدا ترکیبی از سلول‏ها با پادتن‏های مونوکلونال جفت شده با نشانه‏های فلوروسنتی نگهداری میشود، سپس سلول‏هایی که دارای اپیتوپ (epitope) مناسب هستند با پادتن‏های نشان دار باند می شوند.

در این دستگاه ترکیب به صورت جریانی از سلول‏ها در می آیند که به وسیله مبدل لرزشی به قطره‏های کوچک شکسته می شود.

سپس باریکه لیزر به سلول‏ها تابانده شده و پرتو حاصل توسط فوتومالتی پلیر (تشدید کننده نوری) دریافت می گردد و متعاقباً پردازش انجام می گیرد.

سلول‏ها در خلال این پردازش به نحوی باردار می شوند که به خوبی توسط صفحات باردار منحرف کننده قابل انحراف باشند.

از آنجا که دستگاه قادر به انتگرال گیری کلیه اطلاعات است پس از برخورد باریکه لیزر با سلول‏های مورد نظر، یک بار مختصر به صفحات منحرف کننده اعمال می شود که نتیجه آن انحراف سلول‏های نشان دار و از دست رفتن سلول‏های بدون نشان است به طور کلی عمل جداسازی در دستگاه FACS بر اساس هر گونه خصوصیت سلولی که توسط پراکندگی یا انتشار نور باشد انجام می‏گیرد.

با توجه به پیچیدگی دستگاه، عمل دسته بندی می تواند بر روی بیشتر از یک پارامتر انجام شود، از جمله، اندازه گیری شکل سلول اندازه سلول و انواع ویژگی‏هایی که توسط برچسب گذاری فلورسانس (نشانه گذاری فلورسانس) قابل بررسی هستند.

شناسایی سلول‏ها در سیستم هماتوپوئیتیک (خون سازی) با استفاده از روش سلول سنجی روان انجام پذیرفته است.

این سلول‏ها به خوبی قابل تشخیص بود و پادتن‏های مونو کلونال فراوانی در تضمین نتیجه بخش بودن آنها وجود دارد.

این شناخت به همراه ایزولاسیون می تواند کاملاً مؤثر بوده و در نتیجه سلول‏های کم چگالی توسط این روش به خوبی تفکیکی می شوند.

-دسته بندی رشته ای ایمنی مغناطیسی و دسته بندی سلول مغناطیس فعال شده (MACS) Immunomagnetic Bead Sorting and Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) روش دسته بندی رشته ای ایمنی مغناطیسی و دسته بندی سلول مغناطیسی فعال شده از پادتن‏های مونوکلونال و دیگر مولکول‏های گزینش شده با خاصیت مغناطیسی برای گزینش سلول سود می برد.

به طور کلی، در این روش ترکیبی، آمیزش سلول با پادتن اصلی مونوکلونال برای اپیتوپ معینی نگهداری می شود.

رشته‏های مغناطیسی با پادتن‏های ثانویه گوناگونی پوشیده شده و سلول‏ها و رشته‏ها با هم رشد می یابند.

سلول‏های نشاندار ویژه با اتصال به ذرات مغناطیسی پادتن ثانویه را حمل می کنند.

لوله ای که ترکیب فوق را حمل می‌کند در مقابل مغناطیس قرار داده می شود در نتیجه رشته‏های حامل سلول به سمت مغناطیس کشیده می شوند.

سلول‏های غیر متصل به رشته مغناطیسی را می توان به بیرون منتقل کرد، این فرایند را می توان چندین بار تکرار نمود تا سلول‏های غیر متصل به کلی خارج شوند.مثالی از این روش در مطالعات تصفیه سلول‏های از جزایر لانگرهانس موش آورده شده است.

یک نمونه از گزینش غیر پادتنی که رشته مغناطیسی را مورد استفاده قرار می دهد در مطالعاتی که در آن سلول‏های اندوتلیال میکروشریانی از داخل جزایر لانگرهانس پاکسازی شد، آمده است.

رشته‏های پوشیده شده با آلگولتینین-1 اولکس یوروپاوس (Ulex europaus) برای باند کردن سلول‏های اندوتلیال شریان‏های بسیار کوچک استفاده شدند.

این ایزولاسیون نشان دهنده ویژگی منحصر به فرد سلول‏های اندوتلیال است که نظریه مبنی بر اهمیت محل آناتومی درحالت فنوتیپیک سلول‏های مشابه را تأئید می‌کند.

گزینش می تواند مثبت یا منفی باشد: مثبت یعنی سلول مورد نظرنشان دار بوده و تحت تأثیر میدان مغناطیس قرار می گیرد و منفی یعنی آلاینده سلول غالب نشان دار بوده و باند شده است و سلول مورد نظر پاک گردیده است(منتقل گردیده است.) مزیت گزینش منفی این است که سلول‏های مورد نظر به رشته‏های مغناطیسی پیچیده نشده ولی رشته‏های بزرگ ممکن است بر اتصالات بعدی روی سطوح کشت بافت تأثیر بگذارند.

اگر نیاز به گزینش مثبت باشد پاکسازی رشته‏ها از سلول‏های مورد نظر صورت گرفته و این عمل با استفاده از ضدسرم ضد فب (anti-Fab) انجام می شود.

رشته‏ها توسط گوارش آنزیمی پاک می شوند اما این کار ممکن است بر سلول تأثیر بگذارند.

دو روش دیگری به نام گزینش سلول (CELLection) DNA کوتاه بین رشته ای و پادتن توسط دی (DNASE) از هم باز می شوند.

در این روش رشته‏های داینا (Dyna beads) از داینال (Dynal) مورد استفاده قرار می گیرند.

طراحی دیگر رشته MACS که توسط میلتنی بیوتک با مسئولیت محدود صورت گرفت این معایب را ندارد اگر چه رشته‏های داینا از دیدی دیگر با توجه به داشتن توانایی در احیای سریع سلول یک مزیت به حساب می آیند.

استفاده از رشته‏های میلتنی nm 50 به یک ستون گزینش نیاز دارند.

در قسمت نخست ستون سلولهایی قرار دارند که دارای نشان‏های ویژه هستند.

باقیمانده ستون را تا زمانی که میدان مغناطیسی برقرار است، رشته مغناطیسی تشکیل می دهد.

ستون فوق قابل شستشو بوده و در اثر شستشو سلول‏های غیر متصل به رشته مغناطیسی خارج می شوند.

به محض برداشتن میدان مغناطیسی از روی ستون سلول‏های متصل به رشته شسته می شوند.

مطالعات انجام شده بر روی رشته‏های داینا و سیستم ستون‏های میلتنی از میدان‏های نسبتاً مغناطیسی مرتبط با این ذرات بهره می برند.

در این دو مرحله گزینش دو نوع سلول نشانه دار سطحی بدون حذف اولین مجموعه از رشته‏های مغناطیسی به کار برده می شوند.

در ابتدا گزینش مثبت با سیستم میلتنی رخ می دهد که توسط گزینش مثبت یا منفی رشته‏های داینا دنبال می شود.

توان مغناطیسی گزینش گر داینال قادر به جذب رشته‏های بزرگ تر داینا بوده اما توانائی جذب رشته‏های کوچک میلتنی را ندارد.

دستگاه FACS برای دسته بندی سلول پرهزینه است.

بنابراین دسته بندی مغناطیسی به عنوان روش ایزولاسیون و گردآوری سلول در هنگام استفاده از پادتن‏های مونوکلونال برای جداسازی سلول‏ها ترجیح داده می شود.

هر دو این روش‏ها برای کار با سیستم سلول خون سازی نسبت به سلول‏های بافت‏های دیگر سازگارتر هستند.

سلول‏ها سیستم خون سازی تا حدود زیادی با ماتریس برون سلولی (extracellular matrix) ارتباط نداشته و به خوبی برای سوسپانسیون (تعلیق) کارآیی دارند.

این دو مشخصه شرایط لازم برای بهره گیری از مزایای این روش‏ها را فراهم می‌کند.

با این وجود سلول‏های بافت‏های سخت ذیل توسط این گونه روشهای ایمنی گزینش می شوند: سلول‏های کشت یافته ماهیچه‌ای سلول‏های اندوتلیال آئورت، گزینش سلول‏های لومینال ومایواپیتلیال پستانی، گزینش بخش‏های مختلف نفرون پروگزیمال، غنی سازی زیر جمعیت‏های سلول‏های اپیتلیال تنفسی و گزینش سلولهای حاوی کالی کرین از سلول‏های لوله ای کلیوی محدودیتی که برای سلول‏های غیر خون ساز وجود دارد چسبندگی بیشتر آنهاست که اجازه شارش مناسب در ستون‏ها را نمی دهد.

گردش جریان در FACS از سلول‏های توده ای جلوگیری می کند، بدین ترتیب سبب بهبود خلوص می گردد.