دانلود تحقیق الکتروفورز

الکتروفورز به سبب اینکه ماکرومولکول های زیستی مانند دی‌ان‌ای و پروتئین ها باردار هستند می‌توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد.

برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می‌شود.

روش های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول ها اعم از اسید های نوکلئیک یا پروتئین ها ابداع شده است.

الکتروفورز ژل از یک محیط نیمه جامد (ژل) به عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود.

این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی‌اکریل آمید ( PAGE) و الکتروفورز ژل آگارز تقسیم می‌شود.

الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالائی بوده و برای تفکیک پروتئین ها و اسید های نوکلئیک به کار گرفته می‌شود.

به منظور بررسی پروتئین ها با استفاده از PAGE، به سبب اینکه پروتئین ها دارای بار مختلف هستند، معمولاً برای اینکه تفکیک فقط براساس وزن مولکولی انجام شود به بافر ماده شیمیائی SDS (سدیم دو دسیل سولفات ) اضافه می‌شود.

SDS مولکول بزرگی با بار منفی می‌باشد.

این ماده باعث واسرشت شدن پروتئین ها شده و به آنها متصل می‌شود.

به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می‌شود که باعث القاء بارمنفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می‌شود.

هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می‌نماید.

برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می‌شود.

تهیه ژل مزبور به مراتب سریعتر وآسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می‌گیرد.

معمولاً برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگ‌تر از 500 جفت باز) در صورتیکه هدف صرفاً بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است.

برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته‌ای و قطعات DNA تک رشته‌ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می‌شود.

قدرت تفکیک ژل های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد.

برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه 100 جفت باز از آگاروز 3% و برای قطعات حدود 2000 جفت باز از آگارز 8/0 % استفاده می‌شود.

در صورتیکه نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته‌ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل هم‌زمان با الکتروفورز استفاده می‌شود.

به این نوع ژل ها، ژل واسرشت کننده می‌گویند.

چنین ژل هائی پیچ و تاب های اسید های نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می‌شود.

در این ژل ها مولکول های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول های بزرگ‌تر سریعتر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌کنند.

از روش PAGE برای بررسی جهش‌ها و تعیین توالی دی‌ان‌ای استفاده می‌شود.

تاریخچه ی الکتروفورز دو بعدی الکتروفورز روشی است که در آن نمونه هایی که بار الکتریکی دارند، تحت تأثیر یک میدان الکتریکی از میان شبکه ای متخلخل حرکت می کنند و از یکدیگر جدا می شوند.

سیر تکوین وتکامل این روش در جداسازی پروتئینها ارتباط تنگاتنگی با تلاشهای انجام شده در بررسی پروتئینهای سرم دارد.

در سال1937، "Tiselius" روشی برای جداسازی الکتروفورتیک پروتئینهای سرم ابداع کرد.

انگیزه اصلی برای طراحی این روش، که بعدها به الکتروفورز منطقه ای " Zone Electrophoresis" مشهور شد، مشکلاتی بود که درحین بررسی پروتئینهای سرم وجود داشت.

"Tiselius" برای اولین بار فراکشن های آلفا ، بتا، و گاما را در سرم تشریح و نام گزاری کرد.

وی به خاطر تحقیق بر روی الکتروفورز و آنالیز جذبی، بخصوص اکتشافاتی که ماهیت پیچیده ی پروتئینهای سرم را مشخص می کرد، جایزه ی نوبل شیمی را در سال 1948 از آن خود کرد.

نقطه ی عطف در توسعه الکتروفورز در دهه های 40 و 50 زمانی روی داد که علاوه بر الکتروفورز منطقه ای دو روش دیگر نیز ظهور کردند: ایزوالکتروفوکوسینگ ", IEFIsoelectrofocusing" و ایزوتاکوفورزیز " Isotachophoresis".

بنابراین در آن زمان امکان انجام آنالیزهای جداسازی الکتروفورتیک سه گانه بر روی مخلوطهای پروتئینی یا بصورت جدا یا در ترکیب با همدیگر بوجود آمد.

اولین تجارب در جداسازی توسط الکتروفورز دوبعدی به کارهای Smithies و Poulik در سال 1956 باز می گردد که با بکار بردنِ ترکیبی از الکتروفورز بر روی کاغذ و بر روی ژل نشاسته پروتئین های سرم را جداو تفکیک کردند.

پیشرفتهای بعدی در فناوری الکتروفورز، نظیر استفاده از پلی آکریل آمید و استفاده از شیبهای غلظتی پلی آکریل آمید، به سرعت در جداسازی های دو بعدی به کار گرفته شد.

به خصوص استفاده از"IEF" در جداسازی دو بعدی این امر را امکان پذیر ساخت که جداسازی بُعد اول بر پایه خصوصیات بار الکتریکی پروتین ها صورت پذیرد.

در سال 1970 الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید به همراه سدیم دو دسیل سولفات " Sodium Dodecylsulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE" توسط "Laemmli" معرفی شد.

ترکیب "IEF" با "SDS-PAGE" در بُعد دوم منجر به ابداع روشی گشت که پروتئین ها را بر پایه دوعامل متفاوت یعنی بار الکتریکی و جرم مولکولی از یکدیگر جدا می ساخت.

این روش برای انواع متفاوتی از نمونه ها با خواص حل پذیری متفاوت انطباق یافت؛ بدین معنی که استفاده از اوره و دترجنت های غیریونی در "IEF"، امکان محلول سازی نمونه های متفاوت را فراهم نمود.

بدین ترتیب تا سال 1975 یک سیستم الکتروفورز دوبعدی تکامل یافت که می توانست برای آنالیز مخلوط های پروتئینی بدست آمده از کلِ یک سلول یا بافت ها بکار گرفته شود.

براساس این پیشرفتها "O’Farrell" درسال 1975 روش الکتروفورز دوبعدی را که برای جداسازی پروتئینهای "E.coli" بهینه شده بود، گزارش کرد.

او در این روش از ایزوالکتروفوکوسینگ در ژلهای پلی آکریل آمید استوانه ای که حاوی 8% اوره و 2% "NP40" بود، در ترکیب با"SDS-PAGE" ناپیوسته ی"Laemmli" استفاده کرد.

ترکیب جداسازی بر پایه بارالکتریکی (نقطه ایزوالکتریک یاpI) وجداسازی براساس اندازه (جرم مولکولی نسبی یا Mr ) باعث می شود که پروتئین های نمونه در پهنای ژلِ دوبعدی توزیع شوند.

این شگرد اساس پیشرفت و تکامل الکتروفورز دوبعدی را در 30 سال بعدی تشکیل داد به طوری که تا کنون هزاران مقاله با استفاده از آن انتشار یافته است.

3- روشهای آماده سازی نمونه قدم اول در آماده سازی نمونه, استخراج پروتئین ها از منبع مورد نظر است.

ممکن است استخراج پروتئین ها مستقیما" توسط بافر محلول سازی "Solubilization buffer" صورت پذیرد.

ممکن است این عمل توسط روش های متلاشی ساختن سلولها "Cell disruption" و بافتها انجام شود و سپس پروتئین های استخراج شده در بافر محلول سازی کاملا" حل شوند.

برای استخراج کامل پروتئینهای داخل سلولی، سلول باید کاملا" متلاشی شود.

انتخاب روش متلاشی سازی بستگی به این دارد که نمونه از چه منبع بیولوژیکی, از سلول, بافت جامد و یا از منابع دیگری, بدست آمده باشد.

بعد از استخراج, این نمونه ها باید برای انجام الکتروفورز دوبعدی آماده شوند.

منظور از آماده سازی نمونه, محلول ساختن حداکثر پروتئین های موجود و حفظ حلالیت آنها در حین روند الکتروفورز دو بعدی است.

هیچ روش منفردی را نمی توان بصورت عمومی برای آماده سازی نمونه هایی که توسط الکتروفورز دو بعدی مورد بررسی قرار می گیرند, معرفی کرد.

در واقع ماهیت متفاوت نمونه ها امکان بکار گیری روشی یکسان را در آماده ساختن آنها برای الکتروفورز دو بعدی منتفی می سازد.

از طرفی دیگر، روش بکار گرفته شده در هر تجربه ای به هدف طراحی شده نیز بستگی دارد.

برای مثال, ممکن است هدف از انجام الکتروفورز دوبعدی دستیابی به پروتئینهایی با ویژگی های خاص باشد یا ممکن است دستیابی به نقشه کامل از پروتینهای نمونه از اهمیت بیشتری برخوردار باشد, در هر یک از این موارد استراتژی های انتخابی کاملا" متفاوت خواهند بود.

در بهینه ساختن استراتژی آماده سازی نمونه باید از نتایج موردنظر, انتظاری مشخص داشت؛ باید برای ما مشخص باشد که نشان دادن نمونه بطور کامل مهمتر است یا بدست آوردن یک الگوی تکرارپذیر.

اضافه تر کردن مراحل آماده سازی نمونه می تواند کیفیت نتیجه نهایی را بهتر کند, اما این امر به قیمت از دست دادن گروهی از پروتئینها تمام می شود.

به هرحال, این تناقص و نسبت معکوس بین کیفیت نمونه بهبود یافته و نمونه سازی کامل پروتئینها باید کاملا"درنظر گرفته شود.

در هر صورت, خطوط راهنمای کلی برای آماده سازی نمونه وجود دارد که با پی گیری آنها می توان قدمهای نخست را در این راه به درستی برداشت و سپس با تجربه بهترین نتیجه را بدست آورد 3-1 رهنمودهای کلی در آماده سازی نمونه برای الکتروفورز دو بعدی روش بکار گرفته شده در آماده سازی نمونه باید علاوه بر کارآمد بودن, قابلیت تکرارپذیری نیز داشته باشد.

این امر رمز انجام موفقیت آمیز الکتروفورز دوبعدی است.

در روش بکار گرفته شده ممکن است از بافری ساده برای محلول سازی یا از مخلوطی پیچیده حاوی عوامل کائوتروپیک "Chaotropic reagents"، دترجنت ها "Detergents" و عوامل احیاء کننده استفاده شود.

در هر حال بهینه کردن روش آماده سازی نمونه بصورت تجربی صورت می پذیرد و برای دستیابی به این مهم می توان برخی رهنمودهای کلی را در آماده سازی نمونه درنظرگرفت: به حداقل رساندن مراحل آماده سازی نمونه.

افزایش در مراحل آماده سازی نمونه ممکن است کیفیت نتیجه نهایی را بهبود بخشد, اما این امر ممکن است با هزینه احتمالی از دست دادن پروتئینها همراه باشد .

به حداقل رساندن تغییرات پروتئینی ناشی از عوامل داخلی و خارجی.

چنین تغییراتی می توانند سبب ظهور نقاطی مصنوعی در نمایه ی ژل الکتروفورز دو بعدی شوند.

برای مثال نمونه هایی که حاوی اوره هستند نباید حرارت داده شوند چون تخریب حرارتی اوره ایجاد ایزوسیانات می نماید.

ایزوسیانات حاصل می تواند با کاربامیله کردن "Carbamilation" پروتئین ها سبب هتروژنی قابل ملاحظه ای در بار الکتریکی شود و ایجاد نقاط غیر واقعی در نمایه الکتروفورز دو بعدی نماید.

علاوه بر این پروتئازهای موجود در نمونه ها با تخریب آنزیماتیک پروتئینها به سهولت ایجاد نقاط غیر واقعی می نمایند.

به همین دلیل نمونه ها باید حدالامکان درکمترین حد ممکن دستکاری شوند و در تمام طول مدت کار خنک نگهداری شوند.

معجون های وقفه دهنده ی پروتئازی "Protease inhibitors cocktails" را می توان به نمونه اضافه کرد، اما این نکته را باید درنظر گرفت که چنین موادی نیز ممکن است سبب هتروژنی در بار الکتریکی پروتئینها و در نتیجه ظهور نقاط غیر واقعی شوند.

محلول ساختن همه ی انواع پروتئینها, از جمله پروتئینهای آبگریز به شکلی تکرارپذیر.

برخی پروتئینها بطور طبیعی به صورت کمپلکسهایی در غشاء هستند.

یا برخی ها در کمپلکسهایی با اسیدنوکلئیک پیدا می شوند.

برخی دیگر ایجاد توده های "Aggregates" غیراختصاصی متفاوتی می کنند.

روش محلول سازی باید طوری تمامی باندهای غیرکوالان در کمپلکسها و توده های پروتئینی را تخریب کند که محلولی از پلی پپتیدهای منفرد ایجاد شود.

در غیر این صورت, کمپلکسهای پروتئینی نقاط جدیدی را در نمایه دوبعدی ایجاد می نمایند که همزمان منجر به کاهش شدت نقاط مربوط به پلی پپتیدهای منفرد تشکیل دهنده اشان می شوند.

کارآمد بودن بستگی به انتخاب روش محلول سازی دارد .

انتخاب دترجنت ها و ترکیب بافر محلول سازی بسیار پر اهمیت است.

اگر هریک از این مراحل بهینه نشوند، ممکن است جداسازی ناقص انجام شده و بهرحال اطلاعات پر اهمیتی از دست داده شوند.

ممانعت از توده شدن پروتئینها در حین محلول سازی و در طی مراحل بعدی الکتروفورز و جلوگیری از رسوب کردن پروتئین ها و ازبین رفتن حلالیت آنها در حین ایزوالکتروفوکوسینگ.

خارج ساختن اسیدهای نوکلئیک و دیگر مولکولهای تداخل کننده نظیر لیپیدها, پلی ساکاریدها, و نمکها که در ایزوالکتروفوکوسینگ اختلال ایجاد می نمایند.

تمام موادی که می توانند ذراتی را تشکیل دهند باید با اولتراسانتریفوژ خارج کرد.

قطعات جامد و لیپیدها باید از محلول خارج شوند چراکه می توانند منافذ ژل را مسدود کنند .

حذف پروتئینهایی با فراوانی بالا که دیگر پروتئین های مورد نظر در نمونه را تحت پوشش خود قرار می دهند.

مثلا" حذف آلبومین یا ایمونوگلوبولین ها از پلاسما در بررسی دیگر پروتئینهای موجود در پلاسما.

این کار موجب دستیابی به پروتئینهای موردنظر درسطوح قابل اندازه گیری می گردد.

3-2- انواع نمونه ها روش های آماده سازی مطلوب برای تمونه های بدست آمده از منابع متفاوت اختلاف فاحشی با یکدیگر دارند.

این امر به خاطر ماهیت و ساختار این منابع است.

در این قسمت به انواع نمونه های مورد استفاده می پردازیم.

3-2-1- نمونه های محلول نمونه های محلول و مایع نظیر سرم, پلاسما, ادرار, مایع نخاعی و عصاره های مایع سلولها و بافت ها را می توان اغلب با کمترین دستکاری توسط الکتروفورز دو بعدی بررسی کرد.

نمونه هایی نظیر پلاسما و سرم که دارای غلظت پروتئینی نسبتا" زیادی هستند را می توان مستقیما" بعد از رقیق کردن با بافر محلول کننده ی مناسب توسط الکتروفورز دو بعدی آنالیز کرد.

با این حال فراوانی بالای پروتئینهایی چون آلبومین و ایمونوگلوبین ها باعث مخدوش شدن بسیاری از اجزای اقلیت در نمایه ی الکتروفورز دو بعدی می گردد.

با خارج کردن این پروتئینها از محلول می توان بر این مشکل غلبه کرد، اما همیشه احتمال خارج کردن غیر اختصاصی دیگر اجزای پروتئینی نیز وجود دارد.

ممکن است نمونه های محلول دارای غلظت های نسبتا" کم پروتئینی بوده و یا حاوی غلظت های بالا از نمک هایی باشند که قادر به اختلال درجداسازی پروتئین ها درحین "IEF" باشند.

چنین نمونه هایی را می شود قبل از الکتروفورز دو بعدی با دیالیز یا کروماتوگرافی, نمکزدایی کرد, سپس این نمونه ها نیاز به تغلیظ شدن دارند که توسط روشهایی چون لیوفیلیزاسیون، دیالیز درمقابل پلی اتیلن گلایکول، یا رسوب دادن توسط اسید تری کلرواستیک "Trichloroacetic acid, TCA" با استن انجام پذیرد.

رسوب دادن توسط "استن-TCA" برای غیرفعال کردن پروتئازها, خارج ساختن محتویات تداخل کننده، و برای غنی ساختن پروتئینهای بسیار قلیایی، نظیر پروتئینهای ریبوزومی، در محلول لیز شده ی سلولی بسیار مفید است.

3-2-2- نمونه های بافتی نمونه های بافتی جامد معمولا" درحضور بافر محلول کننده از هم می پاشند.

بهترین روش، خرد کردن بافت درحالی است که در دمای نیتروژن مایع یخ زده است.

نمونه های بافتی کوچک که در پوششهای آلومینیومی قرار داشته و در نیتروژن مایع یخ زده اند را می توان با قراردادن میان دو بلوک خنک یا با استفاده از هاون در زیر نیتروژن مایع خرد کرد.

قطعات بافتی بزرگ را می توان با هموژنیزه کردن در بافر محلول کننده و با استفاده از هموژنایزرهایی با تیغه چرخان آماده کرد، اما باید افزایش دما در این وضعیت به حداقل رسانیده شود.

یک مشکل خاص در آنالیز نمونه های بافتی ماهیت ناهمگون این نمونه ها است.

انواع مختلف سلولی ممکن است در نمونه های بافتی موجود باشد و در نمونه های بیمار ممکن است امکان جمع آوری جداگانه قسمت های سالم و بیمار بافت وجود نداشته باشد.

روشهای مختلفی برای مبارزه با این مشکل بکارگرفته شده است.

با استفاده از گزینش مثبت یا منفی و معمولا" بر اساس یک روش ایمونوافینیتی، امکان غنی ساختن جمعیت خاصی از سلولها وجود دارد.

این سلولها را می توان مستقیما" تحت بررسی با الکتروفورز دو بعدی قرارداد، یا می توان با کشت کوتاه مدت قبل از الکتروفورز دو بعدی تعداد آنها را افزایش داد.

روش دیگر جداساختن میکروسکوپی"Microdissection" برای بدست آوردن جمعیت سلولی خالص از یک قطعه بافتی است.

استفاده از ",LCMLaser capture microdessection" دارای جاذبه ی خاصی است.

در این روش، گزینش سلولی با فعال ساختن یک ورقه ی انتقال دهنده که در تماس با قطعه ی بافتی قرار داده شده است، صورت می پذیرد.

با کمک میکروسکوپ معکوس "Scraper" ناحیه ی مورد نظر انتخاب می شود.

ناحیه ای از ورقه که با لیزر هدف گیری شده است به بافت زیر خود اتصال می یابد و این سلولها از بافت های اطراف جدا می گردند.

این روش به سهولت برای آنالیز اسیدهای نوکلئیک بخاطر دردسترس بودن ", PCR Polymerase Chain Reaction" قابل استفاده است، چراکه "PCR" مقادیر کم مواد موجود در چنین نمونه ای را تقویت و زیاد می نماید.

در دسترس نبودن روشی قابل مقایسه با "PCR" برای افزایش دادن پروتئینها، چالش اصلی در "LCM" برای جداسازی سلولها برای بررسی پروتئوم است.

3-2-3- سلولها برای برداشت سلولهایی که در محیط آزمایشگاه به صورت سوسپانسیون رشد داده می شوند یا نمونه های سلولی موجود در گردش خون، مثل لنفوسیتها و اریتروسیتها، موثرترین روش سانتریفوژ کردن است.

چنین نمونه هایی پس از سانتریفوژ توسط بافر فسفات سالین "PBS" شستشو داده می شوند و سرانجام در بافر محلول کننده حل می شوند.

در مورد سلولهایی که در محیط های جامد کشت داده می شوند، باید در وحله اول سلولها را از محیط جامد جدا کرد.

برای این منظور ابتدا لایه سلولها توسط "PBS" یا یک محلول ایزوتونیک حاوی سوکروز شستشو داده شود.

از آنجا که نمکهای موجود در محیط کشت جامد و نمونه می توانند با بعد اول الکتروفورز یعنی "IEF" تداخل شدیدی ایجاد نمایند، شستشو با محلول ایزوتونیک سوکروز برای کاهش دادن میزان نمکهای موجود در نمونه روش بسیار مناسبی است.

بعد از آن می توان سلولها را با لوپ یا اسکراپر "Scraper" برداشت کرد.

استفاده کردن از آنزیمهای پروتئولایتیک بر روی سلولهای مستقر بر محیط جامد توصیه نمی شود اما بجای آن می توان سلولها را مستقیماً درحالی که به محیط کشت چسبیده اند با اضافه کردن مقدار کمی از بافر محلول کننده لیز کرد.

اگر سلولها حاوی مقادیر بالایی از اسیدهای نوکلئیک باشند این امر موجب ویسکوزیتی بالای نمونه می شود.

در این وضعیت نمونه ها باید با معجونی از "DNase" و "RNase" عاری از پروتئاز تیمار شوند 3-3- محلول سازی در نظر گرفتن ماهیت نمونه, در انتخاب راهکار مناسب برای محلول ساختن پروتئین های موجود در نمونه بسیار مهم است.

در صورتیکه نمونه مورد نظر از منابع سلولی یا بافتی استخراج شود اولین قدم لیز سلولها و خارج ساختن محتوای پروتئینی آنهاست.

روشهای متفاوت مکانیکی و شیمیایی درلیز و متلاشی ساختن سلولها به کار گرفته می شود.

این روشها ممکن است روش های ملایمی چون شکست دیواره ی سلولهای باکتریایی توسط آنزیم لایزوزایم "Lysozyme", یا روشهای خشنی چون استفاده از پِرِس فرانسوی "French Press" برای متلاشی ساختن سلولهای مخمری باشد.

به هر حال در روش مطلوبِ محلول سازی برای الکتروفورز دو بعدی باید تمام پیوندهای غیرکوالانت در کمپلکسهای پروتئینی شکسته شده و تجمع های پروتئینی به پلی پپتیدهای منفرد و محلول تبدیل شوند.

به علاوه روش محلول سازی باید اجازه ی خارج ساختن موادی نظیر نمکها، لیپیدها، پلی ساکاریدها، و اسیدهای نوکلئیک را که می توانند باعث اختلال درجداسازی توسط الکتروفورز دوبعدی شوند، بوجود آورد.

درنهایت پروتئینهای نمونه باید درحین روند الکتروفورز دوبعدی محلول باقی بمانند.

به همین دلایل محلول شدن نمونه یکی از عوامل بسیار حساس برای جداسازی پروتئینها توسط الکتروفورز دو بعدی است .

در این قسمت ابتدا به روشهای متداول در لیز و متلاشی ساختن سلولها به منظور استخراج محتوای پروتئینی آنها می پردازیم.

سپس اجزای موثر در روند محلول سازی را مورد بررسی قرار خواهیم داد.

3-3-1- روشهای متلاشی ساختن سلولها روشهای متلاشی ساختن سلولها به منظور استخراج محتوای پروتینی آنها, دامنه وسیعی از روش های فیزیکی و شیمیایی ملایم تا خشن را در بر می گیرد.

ممکن است لیز سلولی به طور مستقیم در تماس با بافر محلول سازی صورت پذیرد یا در مواردی ممکن است از امواج مافوق صوت "Sonication" برای این منظور استفاده شود.

حتی در برخی موارد ترکیبی از روشهای مختلف برای نیل به استخراج کامل پروتئین های نمونه استفاده می گردد.

متلاشی ساختن نمونه ها باید در سرما صورت پذیرد و نمونه مورد نظر در حین این روند باید روی یخ نگهداری شود.

برای حفظ نمونه ی پروتئینی از عملکرد پروتئازهای آزاد شده در حین متلاشی ساختن سلولها باید تمهیداتی در نظر گرفته شود.

یکی از روش های معمول متلاشی ساختن مستقیم سلولها در محلولهای لیز کننده ای است که سریعا" پروتئازها و دیگر فعالیت های آنزیمی را متوقف کنند, این محلولها عموما" دارای مواد دناتوره کننده ی قدرتمندی هستند.

3-3-1-1- روش های متلاشی ساختن ملایم این روش ها عموما" زمانی به کار گرفته می شوند که نمونه ی مورد نظر حاوی سلولهایی است که به راحتی لیز می شوند, سلولهایی نظیر سلولهای بافتی کشت داده شده, سلولهای خونی, و برخی از میکروارگانیسمها.

به علاوه از این روشها در مواردی هم که فقط تمرکز در بررسی یکی از اجزای تحت سلولی است, استفاده می شود.

برای مثال می توان شرایطی را انتخاب کرد که فقط پروتئین های سیتوپلاسمیک آزاد شوند, یا میتوکندریهای دست نخورده یا ارگانل های دیگر توسط سانتریفوژ تمایزی جدا شوند.

برخی مواقع این روشها در ترکیب با یکدیگر استفاده می شوند.

از روشهای ملایم متلاشی سازی سلولی می توان موارد زیر را نام برد: · لیز توسط دترجنت- دترجنت ها غشا های سلولی را حل می کنند و باعث لیز سلول و آزاد کردن محتوای آنها می شوند.

در بیشتر موارد سلولها مستقیما" در بافر محلول سازی یا بافر خیساندن"Rehydration Buffer" لیز می شوند, چرا که این بافر ها همیشه دارای دترجنت هستند.

رایج ترین روش برای محلول سازی پروتئین در الکتروفورز دو بعدی همان روشی است که در ابتدا توسط "O’Farrell" درسال 1975 شرح داده شده است که در آن از مخلوطی از 5/9مولار اوره، 4% دترجنت غیریونی "NP40"، 1% ماده احیاء کننده دی تایو ترایتول ", DTTDithiotriethol"، و2% آمفولایت "Ampholyte"[*]در محدوده pH مناسب استفاده شده است که به آن اصطلاحاً بافر لیزکننده"Lysis Buffer" می گویند.

در حالی که این روش در بسیاری از انواع نمونه ها به خوبی نتیجه می دهد، نمی توان از آن به طور گسترده ای استفاده کرد، چرا که محلول ساختن پروتئینهای غشایی چالش اصلی این روش است.

دترجنت های دویونی"Zwitterionic"، مانند "CHAPS"، در محلول سازی پروتئین های غشایی بسیار مؤثرند، به خصوص زمانی که در غلظت 4% و در ترکیبی با مخلوطی از تیواوره 2 مولار و اوره 8 مولار استفاده شود.

دترژنت های سولفوبتائین خطی نظیر "SB3-10" یا "SB3-12" نیز معرف‌های حل کننده ی مؤثری هستند, اما با غلظتهای بالای اوره سازگار نیستند.

این مسئله با استفاده از غلظت 2% این معرفها در ترکیب با اوره مولار و تیواوره 2مولار و "CHAPS" 2% برطرف شده است.

دترجنت سدیم دودسیل سولفات "SDS" نیز قادر است واکنشهای پروتئینی غیرکووالانت را بشکند و معرف بسیار مؤثری در محلول سازی پروتئینهای غشایی است.

اما خصوصیت آنیونیک این ماده استفاده از آن را در "IEF" دچار مشکل می‌کند.

در هر صورت می توان از "SDS" به عنوان یک روش "پیش-محلول سازی" در مورد نمونه‌هایی که قرار است الکتروفورز دو بعدی گردند, استفاده کرد.

در این روش ابتدا نمونه در 1% "SDS" حل می شود و بعد با محلولهای حل کننده عادی مانند بافر لیزکننده رقیق می شود.

در اینجا هدف خارج کردن "SDS" از پروتئینها و جایگزینی آن با دترجنت های دویونی یا غیریونی است تا پروتئینها در وضعیت محلول باقی بمانند.

نسبت پروتئین به دترجنت دویونی یا غیریونی 1:3 و نسبت "SDS" به این دترجنتهای 1:8 است و این نسبتها باید دقیقاً کنترل شوند تا محلول سازی کاملا" انجام شود و درعین حال اثرات مخرب "SDS" بر روی "IEF" به حداقل برسد.

· لیز اسموزی - این روش در مواردی که نیاز به جداسازی اجزا تحت سلولی است به کار گرفته می شود.

سلولهای خونی و سلولهای کشت بافتی به این روش پاسخ مطلوبی می دهند.

در این روش سلولها در محلولی هیپو اسموتیک"Hyposmotic" قرار داده می شوند.

· لیز توسط یخ زدن و ذوب کردن"Freez-thaw lysis" - در این روش سلولها در یک یا چند نوبت متوالی به سرعت در نیتروژن مایع یخ زده می شوند و سپس ذوب می شوند.

· لیز آنزیمی - دیواره های سلولی در بافتهای گیاهی, سلولهای باکتریایی و قارچی را می توان با استفاده از آنزیم اختصاصی برداشت و سپس سلول را لیز کرد.

لایزوزایم برای سلولهای باکتریایی, سلولاز و پکتیناز برای سلولهای گیاهی, و لایتیکاز برای مخمرها در یک محلول ایزواسموتیک حل شده و مورد استفاده قرار می گیرند.

[*] Ampho+Electrolyteیک حامل مصنوعی متشکل از پلیمرهای صناعی کوچک, محلول و آمفوتری است که دارای قدرت بافری زیاد در نزدیک نقطه ایزوالکتریک خود هستند.

3-3-1-2- روشهای خشن متلاشی ساختن سلولها سلولهای موجود در بافتها و سلولهایی که دارای دیواره سلولی مستحکمی هستند, به سهولت متلاشی نمی شوند و باید از روشهای متلاشی سازی خشن برای لیز آنها استفاده کرد.

باید دقت زیادی به عمل آورد که در حین استفاده از این روشها از ایجاد حرارت و کف ممانعت به عمل آید.

استفاده از امواج مافوق صوت - امواج صوتی تولید شده توسط یک سونیکاتور باعث لیز سلولها از طریق ایجاد برشهایی در دیواره سلولی می شوند.

زمانیکه امواج مافوق صوت حداکثر تلاطم را در سیستم سلولی به وجود می آورند, این برش ها ایجاد می شوند.

برای ممانعت از افزایش درجه حرارت سوسپانسیون سلولی و ایجاد کف, ظرف سوسپانسیون سلولی در حمام یخ قرار داده می شود و سونیکاسیون در مقاطع زمانی کوتاه مدت با فواصل زمانی معین صورت می پذیرد.

پِرِس فرانسوی – ایجاد پارگی در دیواره ی سلولی در این روش به دلیل گذر دادن سوسپانسیون سلولی از منفذی بسیار کوچک تحت فشاری بسیار زیاد است.

این روش بسیار ساده, کارآمد و سریع است و معمولا" برای میکروارگانیسم های دارای دیواره سلولی به کار برده می شود.

آسیاب کردن"Grinding" - برخی مواقع از سیستم هاون دستی مخصوص برای آسیاب سوسپانسیون سلولی یا بافتها استفاده می شود.

برای این منظور قطعه بافتی مورد نظر سوسپانسیون سلولی در نیتروژن مایع یخ زده می شود و با این هاون سلولی پودر می شوند.

می توان برای بهبود این روش به مخلوط در حال هاون شن یا آلومینا (Al2O3) اضافه کرد.

· هموژنیزه کردن - این روش ممکن است بصورت مکانیکی با کمک همزنهای برقی صورت گیرد که عموما" برای نمونه های بافتی به کار گرفته می شود.

استفاده از دانه های شیشه ای"Glass Beads" روش دیگر برای هموژنیزه کردن نمونه های سوسپانسیون سلولی است که با همزدن شدید سوسپانسیون حاوی این دانه های شیشه ای در فواصل زمانی تکراری صورت می پذیرد.

کاربرد الکتروفورز پروتئین‌ها در بررسی مقاومت به شوری چغندرقند در شرایط آزمایشگاهی(In vitro), / چغندرقند(Beta vulgaris L.) گیاهی است که به شوری آب و خاک مقاوم بوده ولی در مراحل اولیه رشد به آن حساس می‌باشد.

به منظور بررسی رابطهء مقاومت به شوری با نوارهای پروتئینی در مرحلهء گیاهچه‌ای، شش تودهء اصلاحی چغندرقند(R2,R1 مقاوم، M2,M1 نیمه مقاوم و S2,S1 حساس به شوری) در محیط کشت مصنوعی MS/2 تحت تنشهای شوری 5، 10 و 15 گرم در لیتر Nacl قرار گرفتند.

محیط کشت بدون NaCl بعنوان شاهد در نظر گرفته شد.

پروتئین‌های کلی گیاهچه‌های حاصل استخراج شده و با روش SDS-PAGE مورد الکتروفورز قرار گرفتند.

برای بررسی امکان کاربرد روش الکتروفورز پروتئین‌ها در بررسی روابط فیلوژنی برخی گونه‌های جنس Beta، پروتئین‌های کل بذر توده‌های اصلاحی مذکور و بذر دو گونه وحشی Beta maritima از بخش Beta lomatogona , Vulgares از بخش Corollinae استخراج و مورد الکتروفورز قرار گرفتند.

تجزیه واریانس داده‌های حاصل از اندازه‌گیری وزن تر و طول متوسط گیاهچهء شش تودهء اصلاحی در چهار محیط کشت نشان داد که برخلاف تقسیم‌بندی اولیهء ژنوتیپ‌ها به مقاوم، نیمه‌مقاوم و حساس ، سه ژنوتیپ S1، M1 و M2 در شرایط این آزمایش و در این مرحلهء رشدی، مقاوم به شوری و بقیه حساس می‌باشند.

تجزیه کلاستر داده‌های استاندارد شدهء حاصل از اندازه‌گیری دو صفت مذکور نیز این نتیجه را تایید نمود.

نتایج حاصل از SDS-PAGE پروتئین‌های کلی گیاهچه‌ها نشان داد که تغییرات کیفی و کمی زیادی در الگوی نواربندی پروتئین‌های گیاهچه‌ای توده‌های اصلاحی در اثر اعمال تنشهای شوری بوجود می‌آید و نوار پروتئینی جدیدی در تمام توده‌ها در سطوح شوری 10 و 15 گرم در لیتر NaCl تولید می‌شود.

لیکن رابطهء مشخصی بین تغییرات کمی و کیفی نوارهای پروتئینی با نوع مقاومت توده‌ها در برابر شوری مشاهده نشد.

SDS-PAGE پروتئین‌های بذری حاکی از وجود پروتئین‌های اختصاصی برای بخش‌های جنس Beta بود.

از این پروتئین‌ها می‌توان به عنوان نشانگرهای مولکولی در تشخیص بخشها و نیز انجام تلاقیهای دور و انتقال ژن از گونه‌های وحشی به واریته‌های زراعی استفاده بعمل آورد.

تجزیه کلاستر داده‌های کمی و کیفی حاصل از نواربندی پروتئین‌های بذری توانست گونه Beta lomatogna را از بقیه متمایز نماید ولی قادر به تفکیک Beta maritima از توده‌های اصلاحی زراعی نگردید.