دانلود تحقیق آشنایی با وسایل آزمایشگاهی

آشنایی با وسایل آزمایشگاهی : آنس ( فلیدوپلاتین ) : که به دو نوع می باشد نوک تیز و حلقه ای که برای انواع کشت ها در محیط های مختلف به کار می رود .

پیست اتوماتیک : پیستی بسیار حساس و دقیق می باشد که دارای تنظیمی در قسمت فوقانی خود می باشد که می تواند از 1 سی سی تا 1000 سی سی تنظیم شود .

این دستگاه دارای قسمت های پلاستیکی می باشد که برای برداشتن مواد از آنها استفاده می شود و یکبار مصرف می باشند .

این اجزای پلاستیکی سر سمپلر می باشند .

فور : دستگاهی برای استریل کردن انکوباتور ( گرم خانه ) : که بعد از کشت برخی محیط ها را برای اینکه در محیط مناسب خود قرار گیرند در آن قرار می دهند .

دمای آن قابل تنظیم بوده همچنین می توان زمان را نیز برای آن تعریف نمود .

اتوکلاو : دستگاهی شبیه به یک زود پز بزرگ می باشد که برای استریل کردن از آن استفاده می شود.

استریلیزاسیون : روندی است که در طی آن همه اشکال میکروبی را اعم از اشکال فعال و اسپورها را از بین می بریم و آن ابزار و یا آن ماده مورد استفاده را عاری از هر گونه میکروب می کند .

استریلیزاسیون به دو صورت خشک و رطوبی انجام می شود .

Stril: ( Dry – wet – filter ) روش های کشت باکتری : هدف از کشت باکتری : باکتری را بتوانیم جدا ایزوله کنیم ( خالص کنیم ) مثلا حیوانی که مبتلا است ( بیمار است ) می توانیم عوامل بیماریزا را از او جدا کنیم و با شناسایی عوامل بیماریزا پی به ماهیت بیماری ببریم .

از کشت باکتریایی کمک می گیریم برای درمان بیماری ( تست آنتی بیوگرام ) که در این تست ها باکتری خالص شده را در اختیار داریم .

می توانیم داروهای متعدد را روی آن آزمایش کنیم و به هر کدام از داروها جواب داد در مورد انسان و یا دام استفاده کنیم .

تهیه واکسن ها : کشت های خالص را بدست می آوریم بعد آنتی ژنهای آن باکتری ها را جدا می کنیم و از آنها واکسن تهیه می کنیم .

محیط های کشت : الف : محیط کشت مایع : (Broth) آبگوشت ، مثال انواع محلولهای قندی مثل گلوکزبرات .

ب : محیط های جامد : Agar : یک پلی ساکارید است .

پلی ساکارید کمپلکسی است که باکتری ها می توانند آن را تجزیه کنند .

( سفت کننده است ) .

ما به طور معمولی محیط های جامد را داخل پلیت تهیه می کنیم ( یک تعدادی داخل لوله ) محیط های مایع همیشه داخل لوله تهیه می شوند .

ج : حالت نیمه جامد : آگار را به میزان کم دارد حالت ژل مانند .

از این محیط ها عمدتا جهت بررسی فاکتور حرکت در باکتریها استفاده می کنیم و در لوله هم تهیه می شوند .

روش های کشت : روش شعاعی : روش کشت T: 3- روش کشت ممتد : 4-کشت یک چهارم (4/1) روش های کشت در لوله : نوترینت آگار زرد رنگ طلایی می باشد .

چهار محیط را ما در این آزمایش کشت دادیم .

در یک پلیت که زرد رنگ بود ( نوترینت آگار ) از محیط e3 کشت دادیم .

در مایع قندی که قرمز روشن بود از محیط e1 کشت دادیم .

در SIM که زرد روشن بود از محیط e3 کشت دادیم .

در TSI که نارنجی رنگ بود از محیط e2 کشت دادیم .

رنگ آمیزی باکتریها : Whole colony : اشکال کلونی : Pnctiform: Circular: ☼☼☼☼☼☼ ЖЖЖЖ Filamentus: ☼☼☼☼☼☼ Rhizoid: ǼĦĦΨΨ Ivregular : ☼☼☼☼☼☼ Flat: Elevation: (شکل جانبی , چقدر بالا رفته) Raised: Convex: Pulvinate: Umbonate: Smooth: صاف Roaph: خشن Drycorn powdery: حالت پودری Sarface appearance: جنس انواع رنگ آمیزی : ساده تفریقی در حالت تفریقی از دو رنگ می توان استفاده نمود که حالت کنتراست داشته باشند .

اما در رنگ آمیزی ساده از یک رنگ استفاده می شود .

هدف ما از رنگ آمیزی تشخیص گران مثبت یا گران منفی بودن باکتری است .

رنگ آمیزی ساده را با متیلن بلو انجام دادیم .

نتایج آزمایش کشت باکتری : کشت در پلیت به صورت کلونی تک دیده می شود .

در مایع کشت بسیار عالی و به رنگ نارنجی در آمده است .

سطح مورب به صورت خوب کشت شده و رنگ آن زرد تیره ( رنگ روغن مایع ) شده است که قبلا قرمز آجری بود .

در SIM مسیر فرو رفتن آنس به صورت ابر مانند می باشد .

Plate : Raised & Circular & Smooth تهیه اسمیر میکروبی و رنگ آمیزی آن : در واقع ما در این تکنیک باکتریهایی را که می خواهیم در زیر میکروسکوپ با اهداف مختلفی بررسی کنیم ابتدا بایستی که یک گسترش را از آنها تهیه کنیم به این صورت که باید یک لایه نازکی از این جمعیت باکتریایی تهیه کنیم بعدا اینها را تثبیت می کنیم روی لام و پس از رنگ آمیزی زیر میکروسکوپ بررسی می کنیم .

برای شروع کار از یک لام تمیز استفاده می کنیم .

ابتدا از آب مقطر یک مقدار بر می داریم خیلی کم روی لام می گذاریم بعد نوک آنس را آغشته می کنیم و در داخل لام کاملا پخش می کنیم بعد در فضای آزمایشگاه باید خشک شده و برای تثبیت از روی شعله رد می کنیم .

تا مدتی که دست را نسوزاند .

مایع را نیز بعد از استریل کردن آنس در محیط مایع فرو می بریم و بعد یک یا دو بار در محیط فرو می بریم و بعد روی لام جدید می ریزیم .

رنگ آمیزی گرم : در روش رنگ آمیزی گرم ما از سه رنگ استفاده می کنیم که 2 تا از این رنگها نقش مستقیم در این رنگ آمیزی دارند و براساس اینکه باکتری ها چه رنگی را به خودشان خواهند گرفت می توان آنها را بعدا دسته بندی کنیم به گرم + و گرم _ ای روش برای اولین بار در سال 1884 توسط کریستین گرند ابدا‌ء شد و به مرور زمان یک سری تغییراتی در آن به وجود آمد ولی به طور کلی اساس کار تفاوت چندانی نمی کرد .

اساس کار: ما ابتدا از یک رنگی استفاده می کنیم بنام رنگ اولیه Primary stain که با این رنگ آمیزی هر دو گروه رنگ خواهند گرفت .

از یک ترکیب رنگ بر استفاده می کنیم ( De colorization agent ) .

رنگی که باعث ایجاد کنتراست می شود .

(Coanterstain) رنگی که باعث ایجاد کنتراست می شود .

(Coanterstain) که در مرحله آخر اجرامی که به وسیله عامل رنگ بر رنگشان را از دست داده اند به این رنگ آغشته می شوند .

رنگ اولیه کریستال ویوله که آبی است .

رنگ بر اتیل الکل 95% است .

رنگ آخر سافرانین یا فوشین است .

(قرمز رنگ).

برای اینکه مراحل از یادمان نرود می توانیم همواره دو کلمه کلاس و کلاف را به خاطر داشته باشیم .

اینکه چرا یکسری از باکتریها رنگ اولیه را به خود جذب می کنند و آن را موقع استفاده از رنگ بر از دست نمی دهند و برعکس یک سری دیگر رنگشان را به راحتی از دست می دهند بنا به یک سری اعتقادات بر می گردد به ترکیب شیمیایی غشاء باکتریها .

ولی شواهدی نیز وجود دارد که ترکیب غشاء نمی تواند چندان در این امر دخیل باشد .

به طور مثال مخمرها که جزء باکتریها اصلا حساب نمی شوند و ساختار دیواره سلولی آنها نیز کاملا متفاوت از باکتریهاست .

ولی در رنگ آمیزی گرم به صورت گرم + دیده می شوند لذا عقیده بر این است که بیشتر منافذی که در غشاء وجود دارند و قابلیت نفوذپذیری این منافذ و یکسری پدیده های فیزیکی در این نحوه رنگ آمیزی دخیل هستند .

در سطح خارجی باکتریهای گرم + قشری از نمک منیزیم ریبونوکلئیک وجود دارد که با رنگ کریستال ویوله و لوگول ترکیب پایدار ایجاد میکند و در اثر مواد بی رنگ کننده نیز این رنگها از باکتری ها خارج نمی شوند و این در حالی است که باکتریهای گرم منفی فاقد این ویژگی هستند .

PH ایزو الکتریکی برای باکتریهای گرم + پایین تر از باکتریهای گرم _ است روی این اصل باکتریهای گرم + در حدود 100 برابر بیشتر از گرم منفی ها کریستال ویوله و ید را جذب می کنند و به راحتی هم این رنگ را از دست می دهند .

گفته می شود که کریستال ویوله و ید در داخل باکتریها با هم ترکیب شده و مولکول درشتی را به وجود می آورند ه این مولکول نمی تواند از جدار گرم + ها خارج شود در حالی که در گرم _ به راحتی می تواند رنگ از طریق دیواره خارج گردد .

بخش اعظم Cell wall گرم _ ها از لیپوپروتئین است و تحت تاثیر ماه رنگ بر الکل و استون چربی های آن حل شده و کمپلکس رنگی خارج می شود .

تذکر مهم : اگر مدت زمان استفاده از رنگ بر طولانی شود باکتریهای گرم+ به صورت گرم _ دیده خواهند شد .

وهمچنین اگر برای تهیه لام از باکتریهای پیر و مرده استفاده شود که اینها قدرت نگهداری رنگ را ندارد بنابراین به رنگ گرم _ در می آیند .

روش کار: ابتدا یک اسمیر میکروبی تهیه می کنیم ، آن را خشک و بعد Fix می کنیم و بعد آماده می شود برای رنگ کردن .

سطح اسمیر را با کریستال ویوله می پوشانیم یک دقیقه صبر می کنیم .

با یک پیست حاوی آب مقطر اضافی رنگ را می شوییم بعد روی آن لوگول می ریزیم و یک دقیقه صبر می کنیم .

بعد از این کار اضافی این را با آب شستشو می دهیم .

بعد از این مرحله از رنگ بر استفاده می کنیم .

باید دقت شود استفاده از اتیل الکل بیش از حد طولانی نشود .

نهایتا روی آن سافرانین یا فوشین می ریزیم و 45 ثانیه صبر می کنیم و اضافی آنرا می شوییم و خشک می کنیم و با میکروسکوب 100 و روغن ایمرسون بررسی می کنیم .

گرم + به رنگ آبی تا بنفش ( که مال کریستال ویوله است ) گرم _ به رنگ قرمز ( که مال سافرانین یا فوشین می باشد ) کلاس : ک, کریستال ویوله .

ل , لوگول .

ا, اتیل الکل .

س , سافرانین .

کلاف : ‌ ک, کریستال ویوله .

ف , فوشین .

موارد مورد مشاهده شده : سرئوس : باسیل بوده و گرم + می باشد .

اورئوس : کوکسی بوده و گرم + می باشد .

لیسترا مونو سایتراژنز: به شکل باسیل های بسیار کوچک بوده و گرم + می باشد .

ایکولای : به شکل باسیل کوتاه بوده و گرم _ است .

نکته : ما در رنگ آمیزی مرحله آخر از فوشین استفاده کردیم .

پس : اورئوس فقط کوکسی ای کولای فقط گرم _ رنگ آمیزی اسپور : یک سری از باکتریها می توانند ایجاد آندسپور کنند که این آندسپور در مقابل شرایط محیطی می تواند در مقابل خشکی مقاومت زیادی داشته باشد .

از آنجایی که ساختار پوششی اسپور به نحوی است که رنگ در شرایط عادی نمی تواند وارد آن شود بنابراین از یک روش خاصی برای این رنگ آمیزی استفاده می کنیم .

به دین صورت که ما ابتدا از رنگ ( مالاشیت گرین ) سبز مالاشیت و جهت تسهیل ورود این رنگ به داخل اسپور آن را حرارت می دهیم .

حرارت دادن نباید به نحوی باشد که موجب تبخیر و یا جوشیدن رنگمان شود .

برای حرارت دادن می توانیم از هات پلیت استفاده کنیم ولی باید دقت کنیم که حرارت تا حد جوش نرسد .

2 الی 3 دقیقه به آن حرارت می دهیم , بعد خنک می کنیم زیر آب شستشو می دهیم و سپس ب روی آن سافرانین اضافه می کنیم به مدت حدودا 30 تا 40 بعد رنگ اضافه را شستشو می دهیم و بعد خشک می کنیم و با میکروسکوپ 100 بررسی می کنیم .

در این روش رنگ آمیزی اسپورها به رنگ سبز و فرم های دیگر سلول باکتری به رنگ قرمز خواهند شد .

در همان روز محیط SS Agar تهیه کردیم به دین صورت که در داخل200 گرم آب مقطر 12 گرم آگار اضافه کرده و به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو می گذاریم .

رنگ آمیزی کپسول : ( رنگ آمیزی منفی ) برای رنگ آمیزی کپسول از Nigrosin استفاده می کنیم .

طریقه درست کردن نیگروزین بدین صورت است که 5/0 گرم از ماده خشک نیگروزین را در 100 سی سی آب مقطر حل می کنیم .

روش کار: یک لام تمیز انتخاب می کنیم در قسمت انتهایی قطره کوچکی از نیگروزین را می گذاریم با استفاده از لوپ ( آنس حلقه ) یک مقدار از کلونی را برداشته و در داخل رنگ حل می کنیم .

با لام دیگر پخش می کنیم و بعد خشک می شود .

محیط های کشت SIM و TSI را تهیه می کنیم .

( SIM حالت ژلوز دارد TSI حالت جامد دارد .) به دین صورت که برای SIM 6 گرم در 200 سی سی آب مقطر که قهوه ای رنگ می شود .

و برای TSI 65 گرم در یک لیتر حل می کنیم که قرمز رنگ است .

سپس آنها را در داخل لوله آزمایش انتقال می دهیم بعد روی آنها پنبه غیر هیدروفیل می گذاریم سپس لوله ها را در داخل یک بشر می گذاریم ( یا ظرف دیگر ) اتوکلاو می کنیم (121 درجه 15 بار 15 دقیقه ) .

در مورد SIM به حالت قائم می گذاریم تا سفت شود .

ولی در مورد TSI جا لوله را کج ( مورب ) می گذاریم .

Agr + آب مقطر Hot plate داخل لوله آزمایش پنبه غیر هیدروفیل بشر اتوکلاو .

از لحاظ ترکیب محیط کشت را 4 قسمت می کنیم .

غنی کننده .

مغذی ( عمومی ) .

انتخابی .

افتراقی .

غنی کننده عمدتا مواقعی استفاده می شود که ما بخواهیم باکتریهایی راکشت بدهیم که یا تعدادشان کم است و یا اینکه در رقابت با سایر باکتریها رشدشان بسیار کم یا اینکه مهار می شود .

محیط کشت مغذی ( عمومی ) ترکیبشان به صورتی است که همه باکتریها و یا به عبارتی اکثریت باکتریها می توانند در آنها رشد بکنند و خود محیط ماهیتا نمی تواند حالت انتخابی برای یکسری از باکتریها باشد .

مگر اینکه فاکتورهای دیگری را مثل دما مدت انکوباسیون و هوازی یا بی هوازی بودن به آنها اعمال شود .

محیط های کشت انتخابی دارای ترکیباتی هستند که برای یکسری از باکتریها تشویق کننده و برای برخی دیگر خاصیت مهار کنندگی دارد و این می تواند یک حالت انتخابی را به وجود بیاورد .

محیط کشت افتراقی را بر اساس خصوصیات بیوشیمیایی باکتریها تقسیم می کنند به این معنی که با توجه به تفاوت هایی که در رابطه با اعمال بیوشیمیایی باکتریها بر روی محیط کشت انجام می دهند و متعاقبا متابولیتهایی را آزاد می کنند بر این اساس می توانیم باکتریها را از هم دیگر تخریب کنیم عمدتا این محیط ها جهت تفریق باکتریهای هم خانواده استفاده می شوند .

محیط نوترینت آگار یا مغذی که جزء دسته دوم حساب می شود و همه باکتریها ( اکثریت ) می توانند در آن رشد کنند .

( زرد روشن می باشد ) .

محیط دوم بلاد آگار که قرمز خون دار بوده و محیطی عمومی است و به آن مقداری خون و فیبرینه اضافه می کنند ( خونی که فیبرینش گرفته شده ) تا قابلیت لیز شدن گلبولهای قرمز توسط باکتریها بررسی شود این محیط طوری است که حساس ترین باکتری ها هم در آن قابلیت رشد پیدا می کنند .

( رب مانند و همه مات هستند ) .

محیط Mac con key Agar : محیط انتخابی برای آنتروباکتریاسه هستند چرا که حاوی یکسری مواد مانند املاح صفراوی و کریستال ویوله بوده که این ترکیبات به گرم مثبت ها اجازه رشد نمی دهند همچنین گرم منفی ها که جزو آنتروباکتریاسه نیستند در این محیط نمی توانند رشد کنند این محیط در درجه دوم یک محیط افتراقی هم به حساب می آید و می توان توانایی باکتریها برای تخمیر قند لاکتوز در آن را بررسی نمود زمانی که باکتریها بتوانند لاکتوز موجود در خون را تخمیر کنند تولید یکسری متابولیتهای اسیدی را می کنند که این متابولیتهای اسیدی در حضور معرف رنگی بنام قرمز خنثی به رنگ قرمز در می آیند .

پس باکتریهایی که لاکتوز مثبت هستند کلونی هایشان به رنگ قرمز دیده خواهد شد .

( شبیه مربا و قرمز روشن ) .

E.coli , kleb + Sal , prot _ EMB ائوزین متیلن بلو آگار : این محیط دارای رنگ متیلن بلو است که جزو رنگهای آنیلینی است و یک حالت انتخابی برای آنتروباکتریاسه دارد و گرم + ها نمی توانند در آن رشد بکنند .

همچنین دارای ویژگی خاص برای تشخیص ای کولای است طوری که کلونی های ای کولای در EMB به رنگ سبز جلای فلزی در می آید .

قرمز تیره ولی شفاف است .

محیط SS Agar ( Sallmonella,shigella Agar ) : این یک محیط انتخابی برای سالمونلا و شیگلا است .

اولا با داشتن املاح صفراوی و سدیم تیوسولفیدها به گرم + ها و گرم _ هایی که خارج آنتروباکترها هستند اجازه رشد نمی دهند .

همچنین دارای ترکیباتی هستند که برای سالمونلا و شیگلا مشوق رشد به حساب می آید مثل سیترات البته لازم به ذکر است که به غیر از سالمونلا و شیگلا سایر باکتریهای خانواده آنتروباکتریاسه می توانند در این محیط رشد بکنند همچنین در این محیط ترکیبات آهن دار هم وجود دارد که از این طریق می توانیم تولید گاز SH2 را توسط باکتری بررسی کنیم در این صورت که ترکیبات آهن دار با SH2 ترکیب و تولید سولفید آهن را می کند که رنگش سیاه است و می توان آن را در مرکز کلونی ها مشاهده کنیم ( سالمونلا ) .

B.A Steph ‌N.A اورئوس MCA ای کولای SSA کلپسیا EMB سالمونلا مرور نتایج جلسه قبل : Steph را کمی قارچ زده بود و قرمز رنگ بود .

اورئوس دارای سطح صاف و موم رنگ بود .

سالمونلا صورتی روشن و دارای سطح صاف بود .

کلپسیا صورتی فسفری ( شب تاب ) و نقطه ای بود .

کشت در چهار محیط جدید : آگار اوره گلوکز برات ( محلول گلوکز ) SIM TSI TSI : Triple suger Iron agar در ترکیب آن سه قند استفاده شده است : گلوکز ، لاکتوز ، ساکاروز .

هدف این است که بتوانیم قابلیت تخمیر قند توسط باکتری در محیط هوازی و بی هوازی را بررسی کنیم ، چرا که از آنجایی که قبلا اشاره شد در صورت رشد باکتری و تخمیر قند باعث می شود که رنگ محیط از حالت قرمز به حالت زرد در بیاید همچنین به علت دارا بودن آهن می توانیم تولید SH2 را بررسی کنیم که در بصورت تولید SH2 رنگ سیاه ایجاد می شود .

در کنار اینها میتوانیم فاکتور تولید گاز را هم توسط باکتری بررسی کنیم اگر گاز + باشد ایجاد یکسری حبابهایی را در داخل محیط کشت می کند و گاهی وقتها تولید گاز به حدی است که حتی محیط کشت را از جای خود بلند می کند در این محیط از رنگ فنول رد استفاده می شود که در PH حدود 8 به رنگ قرمز و در PH های کمتر از 6 به رنگ زرد دیده می شود .

SIM : SH2 Indd Motility در این محیط سه فاکتور حرکت ، تولید گاز SH2 و تولید متابولیت ایندول بررسی می شود .

به لحاظ اینکه یک محیط نیمه جامد است بنابراین به راحتی می شود رد پای باکتری را در آن رد یابی کرد .

همچنین در صورت تولید گاز SH2 محیط به رنگ سیاه در خواهد آمد .

ایندول هم در بصورتی تولید می شود که باکتری دارای آنزیم تریپتوفاناز باشد و بتواند از اسید آمینه تریپتوفان ایجاد ایندول را بکند که باز با استفاده از یک آزمایش تکمیلی می توانیم وجود و تولید ایندول را توسط باکتری بررسی کنیم .

Glc Broth فنیل رد ( قرمز ) زرد رنگ دو فاکتور بررسی می شود : تخمیر گلوگز تولید گاز اوره آگار به صورت مورب ساخته می شود برای بررسی قابلیت تجزیه اوره توسط باکتری از این محیط استفاده می شود .

باکتریهایی که دارای آنزیم اوره آز هستند می توانند اوره را تجزیه کنند .

باکتریهایی مثل پروتئوس که قدرت رشد و تکثیر بالایی دارند می توانند که سریعا در این محیط رشد کرده و اوره را تجزیه بکنند .

در این محیط از معرف فنول رد استفاده می شود که در PH های بالاتر از 8 به رنگ صورتی پر رنگ در می آید .

یعنی اگر باکتری اوره آز + باشد باعث تغییر رنگ به حالت صورتی پر رنگ خواهد شد .

برای بررسی نتایج 24 الی 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد داخل انکوباتور کافی است .

در TSI و SIM می توان ای کولای ، کلبسیلا ، و سالمونلا را کشت نمود .

در اوره آگار کلبسیلا و سالمونلا .

در گلوکز برات استاف و ای کولای .

مواردی که ما کشت دادیم با بررسی بعد کشت به صورت زیر بود .

در محیط SIM در دو لوله مجزا ای کولای و کلبسیلا بود که هر دو به رنگ زرد در آمده بودند .

در محیط TSI در دو لوله مجزا ای کولای و سالمونلا بود که ای کولای به رنگ زرد و سالمونلا به رنگ ارغوانی در آمده بود .

در محیط اوره آگار کلبسیلا بود که به رنگ زرد نارنجی در آمده بود .

( اگر اوره منفی باشد رنگ خودش می شود اگر اوره مثبت باشد به رنگ قرمز در می آید .

) در محیط گلوکوز برات استاف بود که به صورت کپسولی در داخل مایع زرد رنگی دیده می شد .

همچنین جمع شدن گاز در لوله نیز مشهود بود .

حالتهای مختلف رشد باکتری : Black------ sh2 yellow------- اسیدی Red---------قلیایی تولید یا عدم تولید ایندول یک فاکتور تفریقی است .

عده ای می توانند ( با استفاده از آنزیم تریپ توفان ) عده ای نه .

Trp----Indole, ammonia & Pyrovic Acid Indole + kovacs reagent ------- Red color شناسایی ایندول kovacs reagent = HCL & دی متیل آمینو بنز آلدهید & آمیل الکل کواکسی زرد روشن است در صورتی که در محیط ایندول باشد یک قسمت قرمز رنگ دیده می شود .

( ایندول + ) .

کاتالاز تست : یکسری از باکتریها قادرند که اکسیژن 2 ظرفیت را تبدیل سوپر اکسید کنند که برای باکتریها حالت سمی دارد .

ولی یک تعداد از باکتریها هستند که یک مکانیزم دفاعی بر علیه پراکسید هیدروژن و سوپر اکسید دارند .

اینها د واقع دارای آنزیمی هستند که می تواند این فرم از اکسیژن را مجددا به فرم دو ظرفیتی تبدیل کند از آنزیم های مهم که می تواند این واکنش را انجام دهد آنزیم کاتالاز است .

آنزیم کاتالاز قادر است که آب اکسیژنه را تجزیه کرده و آن را تبدیل به آب و اکسیژن آزاد کند که این آزمایش در صورت مثبت بودن به صورت حبابهای گاز در روی لام دیده خواهد شد .

تست Oxidase : برخی باکتریها دارای آنزیم سیتوکروم اکسیداز a3 هستند که این آنزیم جزئی از سیستم انتقال الکترون باکتری به حساب می آید وجود این آنزیم را ما می توانیم از طریق یکسری رنگهای احیاء شونده ردیابی کنیم ، که این رنگها د مجاورت با این آنزیم احیاء شده و ایجاد رنگ بنفش را خواهند کرد .

اگر باکتری اکسیداز مثبت باشد --------- بنفش اکسیداز منفی باشد ---------رنگ کلونی نام رنگ ------------------ تترا فنیل پارا فنیلن دی آمین .

Tetramethyl-p-phenylene di amine تست کوآگولاز : Coagulase هدف ؟

در این تست هدف ما ردیابی یکسری از گونه های استافیلوکوکوس است که اینها قادرند پلاسمای خون را لخته بکنند .

از آنجایی که این خاصیت نشان دهنده استافیلوکوکهای بیماریزا هستند مثل استافیلوکوکوس آرئوس بنابراین یک تست بسیار مفیدی است جهت تفریق این دسته از اسافیلوکوکها از سایر کوکسی های گرم + برای انجام این آزمایش از دو روش استفاده می شود که البته در هر دو روش سوبسترای ما مشترک است و باکتری بر روی پلاسمای سیتراته آزمایش خواهد شد تا قابلیت ایجاد کلات( Clot ) یا لخته تست شود .

روش لوله ای و روش روی لام : در روش لوله کوآگولاز آزاد تشخیص داده می شود برای انجام آزمایش یک مقداری از پلاسمای سیتراته را در داخل یک لوله آزمایش کوچک می ریزیم سپس با استفاده از آنس حلقه از یک کشت تازه ( 18 الی 24 ساعته ) به داخل لوله منتقل میکنیم و لوله را حدود 4 ساعت در 37 درجه انکوبه می کنیم اگر کوآگولاز مثبت باشد در عرض 1 الی 4 ساعت لخته ایجاد خواهد شد .

( تا 24 ساعت هم نگه می دارند ) .

روش روی لام : یک قطره از پلاسمای سیتراته را روی لام قرار می دهیم و یک مقدار از آن کلونی مورد نظر را در داخل این کاملا حل می زنیم ( سعی می کنیم که یکنواخت شود ) در طی چند ثانیه ( 30-15 ) بافت این به صورت دانه دانه خواهد بود که این چون ریز است در زیر لوپ خواهیم دید .

آزمایشات انجام شده : در مورد ایندول کلپسیا ایندول منفی و سبز رنگ .

ای کولای ایندول مثبت و قرمز رنگ .

در مورد کاتالاز ای کولای ، سالمونلا ، استافیلوکوک حباب زدند پس کاتالاز مثبت .

در مورد اکسیداز پاستورلا اکسیداز منفی می باشد .

کوآگولاز: Coagulas یا به شکل tube می باشد و یا Slide .

آزمایش اسلاید یا لام : یک قطره آب مقطر + باکتری ( اول خوب هم می زنیم و آرام آرام با آب مقطر مخلوط می کنیم ) + سرم .

اگر در 30 ثانیه دون دون شود + اگر نشود – است .

اگر حالت دون دون شدن بیش از 30 ثانیه طول کشید مشکوک است و باید از روش لوله استفاده شود .

آرئوس + اپیدرمیوس _ آزمایش قارچها : Fungi Medium: SDA,ME,PDA Caltivation: Stabcultar & Slide culture همواره یک رقابتی بین باتری ها وقارچها در محیط وجود داشته و همانطور که ما سعی می کردیم موقع کشت باکتریها از آلودگی و رشد قارچها پیشگیری کنیم موقع کشت قارچها نیز شرایط را باید طوری تغییر دهیم تا باکتریها قادر به رشد نباشند .

در اینجا نیز از یکسری محیط های اختصاصی برای قارچها استفاده می کنیم .

Saouraud Dextrose Agar ( SDA ) using Abslike ( poly ) Malte Extrect ( ME ) Potato Dextrose ( PDA ) Decreased PH برای اینکه در این محیط باکتریها قادر به رشد نباشند شرایط را طوری تغییر داده اند که فقط قارچها بتوانند رشد کنند به طور مثال در 1 و 2 این کار را با کاهش PH تا حدود کمتر از 5/3 انجام می دهند یعنی با افزودن اسید PH را پایین می آورند ( تا 5/3 ) یا در مورد 1 این مهار را با استفاده از آنتی بیوتیک هایی مثل کلرادم فنی کول و کولی پکسین انجام می دهند .

نکته 1 : دمای انکوباسیون 25 درجه سانتیگراد و به مدت 24 الی 48 ساعت است .

نکته 2 : کشت باکتری به صورت Stab culture است .

ما آزمایش را در محیط SDA انجام دادیم و مواردی را که کشت دادیم به قرار زیر بود .

آسپرژیلوس فومگاتوس ،آسپرژیلوس لیجولنس ،آسپرژیلوس فلاووس ،آسپرژیلوس نایجر ،و پنی سلیوم .

در رنگ آمیزی از لاکتوفنل کاتن بلو استفاده می کنیم .

مشخصات قارچهای کشت داده شده : نیجولنس : سفید بوده حالت پنبه ای و پودری دارد .

دارای پرگنه های بزرگ می باشد .

نایجر : کاملا سیاه بوده و کاملا حالت پودری و ابری دارد و پرگنه ها کوچک تا متوسط است .

پنی سلیوم : پرگنه های متوسطی و زیادی دارد و دارای رنگ سیمانی ( سبز مایل به خاکستری ) می باشد .

از پشت زرد رنگ دیده می شود .

آسپرژیلوس فلاووس : به رنگ سبز یشمی است حالت پودری دارد و پرگنه ها بزرگ می باشند ( به تعداد 5-4 عدد ) .

آسپرژیلوس فومگاتوس : مثل خزه بوده و ریز می باشد ، رنگ آن سبز سپاهی بوده دارای پرگنه های کوچک بوده و برجسته است و مهم ترین مشخصه آن این است که دوره های آن سفید می باشد.

روش رنگ آمیزی : ابتدا رنگ را در روی لام گذاشته و بعد با آنس حلقه مقداری پرگنه بر میداریم و داخل رنگ هم میزنیم تا کامل رنگ را به خود بگیرد و بعد یک لامل روی آن قرار می دهیم .

جهت تشخیص گونه های مختلف آسپرژیلوس از پرگنه ( رنگ ، قوام ، و اندازه پرگنه ) کمک گرفته می شود .

شکل پنی سیلیوم در زیر میکروسکوپ : شکل آسپرژیلوس در زیر میکروسکوپ : کشت کپک ها : A: Stab calture B: Slide calture روش B : در این روش از یک پلیت شیشه ای که کاملا استریل است استفاده می کنیم .

داخل آن یک کاغذ صافی می گذاریم و یک مقدار هم آب مقطر می ریزیم ، بعد لوله های هماتوکریت را در روی شعله به شکل U در می آوریم .

یک لام تمیز بر می داریم .

محیط کشت SDA است که از این محیط باید مقداری به لام انتقال دهیم ما از یک لوله آزمایش تمیز و آنس استفاده می کنیم .

از نمونه ای که قرار است کشت دهیم با آنس نوک تیز برداشته و در 4 نقطه کشت می دهیم و آخرسر یک لامل روی آن می گذاریم بعد به پلیت شیشه ای منتقل می کنیم و در آن را می گذاریم سپس در انکوباتور 25 درجه سانتیگراد به مدت 4 روز می گذاریم .

رنگ آمیزی مخمرها : از رنگ های مختلف مثل متیلن بلو ، سافرانین ، رنگ آمیزی گرم می توان استفاده نمود .

ظاهر آن شبیه به باکتری می باشد .

نام مخمری که ما مورد بررسی قرار دادیم Candida Albicans بود .

بررسی کپک های کشت شده : قسمتی که به لامل چسبیده شده بود قسمت زایشی و قسمتی که روی لام بود قسمت رویشی نام داشت .

قسمت زایشی به دو رنگ آبی و سبز دیده می شد .

آنتی بیوگرام : آنتی بیوگرام یک روش آزمایشگاهی و میکروبیولوژی است که جهت ارزیابی حساسیت باکتریها نسبت به آنتی بیوتیک های مختلف در محیط خارج از بدن صورت می گیرد .

روش معمول برای این کار کشت باکتری در محیط کشت مولر هینتون و سپس قرار دادن دیسک های حاوی آنتی بیوتیک های مختلف بر روی محیط کشت است .

مایع حاوی باکتری را با گوش پاک کن پخش می کنیم و بعد 10 دقیقه صبر می کنیم و سپس بر روی آن کلی آنتی بیوتیک پخش می کنیم ، و بعد 48-24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار می دهیم .

باکتری که ما کشت دادیم ای کولای بود و از آنتی بیوتیک های زیر استفاده کردیم .